唐煥煥，沈曉燕，段小群，徐　慶，苑　博，張嫦麗，呂　良

隱丹參酮抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖及對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的影響

唐煥煥1，沈曉燕2，段小群1，徐慶1，苑博1，張嫦麗1，呂良1

目的 評(píng)估隱丹參酮對(duì)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的增殖作用及對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的影響。方法 使用MTT法評(píng)價(jià)隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞存活率的影響，使用hochest染色和BrdU插入法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞凋亡和增殖的影響，使用Western blot法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3（Tyr705）的影響。結(jié)果 隱丹參酮顯著抑制C6的生長(zhǎng)和增殖（P＜0.05），但不促進(jìn)凋亡。隱丹參酮顯著抑制p-STAT3（Tyr705）蛋白表達(dá)，但不影響p-JAK2。結(jié)論 隱丹參酮是惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6的抗增殖劑，其作用機(jī)制與抑制STAT3信號(hào)有關(guān)。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤；增殖；JAK2-STAT3信號(hào)通路

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.004.html

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，并具有高死亡率［1］。惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的經(jīng)典治療方法包括手術(shù)切除、術(shù)后放射治療和化療（通常用替莫唑胺）。但是，基于這些療法，患者平均存活時(shí)間僅為14.6個(gè)月，并且，在過(guò)去的二十年中，患者的存活率并沒(méi)有顯著改善［2］。因此，為了提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療的效果，探索更有效的治療方法很有必要。隱丹參酮（cryptotanshinone），從丹參中提取分離得到的主要活性成分之一，已經(jīng)報(bào)道具有廣泛的藥理作用。研究［3］顯示隱丹參酮可以減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化病灶的事件，并減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。隱丹參酮通過(guò)抑制RAW264.7細(xì)胞NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制炎性細(xì)胞因子的分泌［4］。同時(shí)，隱丹參酮通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉樣前體蛋白的代謝產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)和抗阿爾茨海默病的作用［5］。研究［6-9］顯示，隱丹參酮具有抗腫瘤的活性。該研究旨在研究隱丹參酮對(duì)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的抗腫瘤作用，并探索其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑 熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本NIKON公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tech公司；C6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM、青霉素鏈霉素雙抗（PS）、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；隱丹參酮、MTT、DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；BrdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)盒購(gòu)自美國(guó)Exalpha Biologicals公司；抗p-STAT3（Tyr705）和抗p-JAK2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；抗GAPDH抗體、hochest33258購(gòu)自蘇州碧云天公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) C6細(xì)胞用高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基，含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml的青霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周1次的間隔，以1∶5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2MTT法 為了測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)行MTT測(cè)定法。細(xì)胞鋪在100 μl 96孔板的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過(guò)夜后，將細(xì)胞用各種濃度的CTS的處理24～48 h，然后用MTT（5 mg/ml）孵育和DMSO（100 μl/孔）溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度值。

1.2.3hochest33258法染色細(xì)胞 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，不同濃度隱丹參酮處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛常溫下固定30 min，PBS洗3次，5 mg/L Hoechst 33258常規(guī)染色10 min，PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4BrdU細(xì)胞增殖試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［10］報(bào)道和BrdU細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒說(shuō)明，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種在96孔板中，密度為每個(gè)孔10 000個(gè)細(xì)胞，并在5%的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天加入0～20 μmol/L濃度的隱丹參酮。隱丹參酮處理48 h后，20 μl的BrdU加入到每個(gè)孔，孵育12 h。然后加入固定液在室溫中培養(yǎng)30 min。洗滌后，細(xì)胞與一個(gè)預(yù)稀釋的檢測(cè)抗體在室溫下孵育1 h。加入HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h后，加入終止液。然后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定光密度值。

圖1　不同濃度隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞形態(tài)的影響 ×100A：隱丹參酮（0 μmol/L）處理組；B：隱丹參酮（2.5 μmol/L）處理組；C：隱丹參酮（5 μmol/L）處理組；D：隱丹參酮（10 μmol/L）處理組；E：隱丹參酮（20 μmol/L）處理組

1.2.5Western blot法檢測(cè) 各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用RIPA緩沖液［含50 mmol/L的Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L的PMSF，1 mmol/L的EDTA，1%的Triton X-100，0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），1 mmol/L的Na3VO4，1 mmol/L的NaF和蛋白酶抑制劑混合物（羅氏公司）］收集蛋白樣品。含等量蛋白的樣品通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。膜在含0.05% Tween-20的PBS中用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4℃中用一抗孵育過(guò)夜。然后將膜用PBS洗滌后，用辣根過(guò)氧化物酶連接的二抗在室溫孵育1 h。條帶通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行免疫發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，用化學(xué)發(fā)光成像儀觀察。

2　結(jié)果

2.1從細(xì)胞形態(tài)角度觀察隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 加不同濃度隱丹參酮后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度、形態(tài)，見(jiàn)圖1，隨著隱丹參酮濃度的增加，細(xì)胞密度減少。

2.2采用MTT法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.87，P＜0.05），隱丹參酮呈濃度依賴性抑制C6細(xì)胞生長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。

2.3使用BrdU摻入測(cè)定法確認(rèn)CTS對(duì)細(xì)胞增殖的效果 各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.08，P＜0.05），隱丹參酮?jiǎng)┝恳蕾囆砸种艭6細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖3。

圖2　隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞存活率的影響與隱丹參酮0 μmol/L組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖3　隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞增殖率的影響與隱丹參酮0 μmol/L組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

2.4采用hochest33258法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞凋亡的影響 不同劑量隱丹參酮（0～20 μmol/ L）處理24 h后細(xì)胞核呈現(xiàn)彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，呈淺染核大形態(tài)，均未出現(xiàn)核碎裂、核固縮等典型細(xì)胞凋亡形態(tài)。見(jiàn)圖4。

2.5Western blot法檢測(cè)隱丹參酮對(duì)激活狀態(tài)的STAT3的作用 STAT3信號(hào)通路在腫瘤生長(zhǎng)中有關(guān)鍵作用，STAT3信號(hào)通路在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈持續(xù)激活狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)研究隱丹參酮是否對(duì)激活狀態(tài)的STAT3具有作用。隱丹參酮（5、10 μmol/L）對(duì)C6細(xì)胞Tyr705位點(diǎn)磷酸化具有抑制作用。為了探索隱丹參酮是否通過(guò)抑制STAT3上游信號(hào)通路引起的其磷酸化水平的變化，本研究檢測(cè)STAT3的上游激酶JAK2的磷酸化水平。隱丹參酮（5、10 μmol/L）處理1 h后，使用Western blot法檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3（Tyr705）和GAPDH蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示隱丹參酮并不影響上游激酶JAK2的磷酸化水平，見(jiàn)圖5。

圖4　不同濃度隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞核hochest33258染色的影響 ×100A：隱丹參酮（0 μmol/L）處理組；B：隱丹參酮（2.5 μmol/L）處理組；C：隱丹參酮（5 μmol/L）處理組；D：隱丹參酮（10 μmol/L）處理組；E：隱丹參酮（20 μmol/L）處理組

圖5　不同濃度隱丹參酮對(duì)C6細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3（Tyr705）的影響

3　討論

本實(shí)驗(yàn)研究了隱丹參酮對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6的增殖作用，并探討其可能機(jī)制。結(jié)果表明：①隱丹參酮具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6生長(zhǎng)的作用；②隱丹參酮抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6的生長(zhǎng)是通過(guò)抑制細(xì)胞增殖途徑，而不是凋亡；③隱丹參酮抑制p-STAT3（Tyr705），但不抑制其上游激酶JAK2。

前期研究［11］中用隱丹參酮處理正常大鼠腦細(xì)胞（原代皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞）顯示，在2.5～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)隱丹參酮對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性。因此本研究使用了上述濃度進(jìn)行大鼠來(lái)源的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。隱丹參酮對(duì)其它類型腫瘤的作用已有部分報(bào)道［6-9］，在HepG2和MCF7腫瘤細(xì)胞，隱丹參酮通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在前列腺癌、白血病和宮頸癌細(xì)胞株，隱丹參酮既誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，又抑制其增殖，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［6-9］。研究顯示隱丹參酮抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用是通過(guò)增殖途徑，且沒(méi)有證據(jù)表明隱丹參酮會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。而在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞STAT3是持續(xù)性激活的，這與正常細(xì)胞不同［12］。因此，特異性靶向STAT3信號(hào)的被認(rèn)為是治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的靶點(diǎn)［13］。

已經(jīng)有文獻(xiàn)［14］報(bào)道，隱丹參酮不會(huì)影響上游激酶的磷酸化水平，如EGFR和Src。因此，本研究選擇檢測(cè)這些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體的下游激酶（JAK2），而這些激酶在膠質(zhì)瘤中是異常激活的。遺憾的是，并沒(méi)有顯示隱丹參酮對(duì)p-JAK2具有改變作用。雖然最近的研究［10］表明，CTS通過(guò)抑制mTOR信號(hào)抑制Rh30和DU145細(xì)胞的增殖。并且，在C5a誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)中，隱丹參酮抑制p-Akt［15］。因此在不同細(xì)胞類型中隱丹參酮可能具有不同的作用和機(jī)制?？梢源_認(rèn)CTS選擇性阻斷STAT3的酪氨酸磷酸化。

綜上所述，當(dāng)前的研究表明，CTS可能是一個(gè)潛在的神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗增殖劑，其機(jī)制可能與STAT3信號(hào)有關(guān)。

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Cryptotanshinone inhibits proliferation of malignant glioma C6 cells and its influence on JAK2-STAT3 signal pathway

Tang Huanhuan1，Shen Xiaoyan2，Duan Xiaoqun1，et al
（1Dept of Pharmacology，Guilin Medical University of Pharmacy，Guangxi 541001；2Dept of Pharmacology and Biochemistry，F(xiàn)udan University of Pharmacy，Shanghai 200120）

Objective To evaluate the effect of cryptotanshinone（CTS）on the proliferation of malignant glioma C6 cells and its influence on JAK2-STAT3 signal pathway.Methods MTT was used to evaluate the survival rate of CTS on C6 cells.Hochest staining and BrdU assay was used to detect the cell apoptosis and proliferation.Western blot was used to detect the expressions of p-JAK2 and p-STAT3（Tyr705）.Results CTS inhibited C6 cells growth and proliferation significantly（P＜0.05），but not induced apoptosis.CTS decreased phosphorylation of p-STAT3（Tyr705），but not p-JAK2.Conclusion CTS may be a potential anti-proliferation agent of malignant glioma C6 cells and that its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signaling.

malignant glioma；proliferation；JAK2-STAT3 signaling pathway

R 966

A

1000-1492（2016）06-0769-04

2016-03-04接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81460619）；廣西自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（編號(hào)：2015GXNSFBA139178）

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，桂林 5410012復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與生物化學(xué)教研室，上海200120

唐煥煥，女，碩士研究生；呂 良，男，講師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：luliang998@163.com