周大新，周　銳，李德群，董慧明，張　暉，朱金海，馬小開(kāi)，陳春春，馬桂凱，陳海龍，王志軍

siRNA抑制HMGA1基因表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖的影響

周大新1，2，周銳1，李德群1，董慧明1，張暉1，朱金海1，馬小開(kāi)1，陳春春1，馬桂凱1，陳海龍1，王志軍1

目的 研究HMGA1-siRNA基因?qū)谞钕偃轭^狀癌K1細(xì)胞增殖的影響。方法 HMGA1-siRNA組轉(zhuǎn)染HMGA1的小干擾RNA（siRNA）；陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染HMGA1的無(wú)關(guān)序列，并轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞。采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HMGA1-siRNA基因后對(duì)K1細(xì)胞增殖的影響；RT-PCR法檢測(cè)正常組、HMGA1-siRNA組和陰性對(duì)照組的HMGA1-mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè)三組的HMGA1蛋白表達(dá)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組HMGA1-siRNA基因轉(zhuǎn)染后K1細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 HMGA1-siRNA基因?qū)1細(xì)胞的抑制增殖作用明顯，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴關(guān)系；HMGA1-siRNA基因在K1細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)顯著低于正常組和陰性對(duì)照組；HMGA1-siRNA組K1細(xì)胞侵襲能力顯著低于正常組和陰性對(duì)照組。結(jié)論 siRNA可以沉默HMGA1基因，減緩甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖。

HMGA1-siRNA基因；甲狀腺乳頭狀癌；K1細(xì)胞；干擾技術(shù)RNA

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.010.html

高遷移率族蛋白A1（high mobility group A1，HMGA1）是一組非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白，屬于高遷移率族蛋白（HMG）的成員，可作為真核生物轉(zhuǎn)錄因子的輔助因子參與轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在正常情況下，HMGA1主要存在于胚胎發(fā)育階段，而迅速增殖的細(xì)胞內(nèi)和分化成熟的組織內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)，已有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道HMGA1基因參與了不同胚胎起源的腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前，在甲狀腺癌組織中HMGA1基因及其具體作用機(jī)制仍知之甚少，在K1細(xì)胞內(nèi)運(yùn)用HMGA1-siRNA研究HMGA1基因功能的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究構(gòu)建HMGA1-siRNA基因并轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株，研究其對(duì)K1細(xì)胞抑制及侵襲力的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑及來(lái)源 兔抗人HMGA1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RT-PCR AMV試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司。

1.1.2細(xì)胞株來(lái)源 人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購(gòu)自上海美軒公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HMGA1-siRNA基因的轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)共分為3組：HMGA1-siRNA組；不加任何干預(yù)設(shè)為正常組；siRNA陰性對(duì)照進(jìn)行干預(yù)設(shè)為陰性對(duì)照組。各組引物序列由上海美軒公司設(shè)計(jì)并合成，序列如下，HMGA1-siRNA上游引物：5′-GCCGGGGCAGGCCGCGCAATT-3′；下游引物：5′-UUGCGCGGCCUGCCCCGGCTT-3′；陰性對(duì)照上游引物：5′-UUCACUCCAAGUCUCUUCCTT-3′；下游引物：5′-GGAAGAGACUUGGAGUGAATT-3′，根據(jù)LipofectaminTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM/F12培養(yǎng)基分組培養(yǎng)人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各組用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，稀釋至5 ×103細(xì)胞懸液，逐步分別接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)，建立人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株。

1.2.3測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞板，該板為96孔板，每孔置入1 000個(gè)細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每天定時(shí)加入10 μl的CCK-8試劑，連續(xù)3 d，待細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)板置入37℃條件下孵育4 h后，測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值。并計(jì)算KI細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.2.4RT-PCR定量分析 細(xì)胞培養(yǎng)建立人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株。引物由上海生物工程公司合成，序列如下，HMGA1上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCACTGAGAAGCGGGGCCG-3′；下游引物：5′-CCCTTGTTTTTTGCTTCCCTT-3′?？俁NA的提取和反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；PCR反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。在瓊脂糖凝膠中觀察PCR產(chǎn)物。并計(jì)算mRNA表達(dá)抑制率。mRNA表達(dá)抑制率：抑制率（%）=（1-對(duì)照組平均相對(duì)灰度值/正常組平均相對(duì)灰度值）×100%。

1.2.5Western blot法檢測(cè) 同上，建立人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株。測(cè)定各樣品蛋白濃度使用BCA法，將漂洗后的凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上（4℃、1 h）。將膜置于5%的脫脂奶粉封閉液，設(shè)置37℃恒溫封閉2 h，β-actin抗體（1∶1 000）/HMGA1抗體（1∶400）加入，4℃搖床上一抗孵育過(guò)夜，加入5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體（1∶4 000），設(shè)置37℃恒溫?fù)u床上溫育1.5 h二抗孵育。將膜置于ECL顯色液中1～5 min曝光，顯影，清洗后放入定影液中定影，最后用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。根據(jù)以下公式計(jì)算蛋白表達(dá)抑制率：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均相對(duì)灰度值/對(duì)照組平均相對(duì)灰度值）×100%。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)同上，建立人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株。Transwell小室底部為8 μm孔徑乙烯濾膜，預(yù)先鋪上Matrigel凝膠（1 mg/ml）100 μl。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，常規(guī)收集細(xì)胞，5組均以無(wú)血清DMEM/F12制成1×105/ml細(xì)胞液，各取100 μl移入小室，小室外加入各200 μl的條件培養(yǎng)和完全培養(yǎng)液。置37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后取出。侵襲并黏附至下室面的細(xì)胞以10%甲醛固定、HE染色。在400倍高倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲力抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。各組間比較用單因素方差分析法，數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1HMGA1-siRNA基因?qū)1細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞分裂增殖旺盛，形態(tài)正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，均出現(xiàn)增殖，在干預(yù)后24 h開(kāi)始出現(xiàn)差異，且作用時(shí)間增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染后K1細(xì)胞增殖的抑制率越明顯，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴關(guān)系（72 h作用最明顯），在各時(shí)間點(diǎn)HMGA1-siRNA組與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 168.23，P＜0.05）；正常組與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染后HMGA1基因?qū)1細(xì)胞增殖的影響與正常組比較：*P＜0.05；與陰性對(duì)照組比較：#P＜0.05

2.2HMGA1-siRNA基因在K1細(xì)胞中mRNA的表達(dá) HMGA1-siRNA處理72 h后，HMGA1-siRNA組mRNA表達(dá)水平、陰性對(duì)照組分別與正常組比較，均明顯降低（正常組：1.000±0.00；HMGA1-siRNA組：0.247±0.02；陰性對(duì)照組：0.931±0.05）（F =388.72，P＜0.05），抑制率分別為75.28%、6.90%。HMGA1基因的mRNA表達(dá)水平在正常組、陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3HMGA1-siRNA基因在K1細(xì)胞中蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h后，與正常組比較，HMGA1-siRNA組和陰性對(duì)照組K1細(xì)胞的抑制率分別為41.68%和2.1%，見(jiàn)圖2。正常組和陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2　轉(zhuǎn)染后HMGA1基因在K1細(xì)胞中蛋白的表達(dá)A：正常組；B：HMGA1-siRNA組；C：陰性對(duì)照組

2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h后，HMGA1組的K1細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)低于正常組、陰性對(duì)照組的細(xì)胞，侵襲力抑制率分別為36.32%、1.23%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=263.85，P＜0.05）。見(jiàn)圖3。正常組與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞侵襲數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) ×300A：正常組；B：HMGA1-siRNA組；C：陰性對(duì)照組

3　討論

目前，基因沉默主要通過(guò)干擾RNA（siRNA）、反義寡脫氧核苷酸和核酶等技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)［4］。研究［5-8］表明，由于siRNA失去了抑制基因表達(dá)的活性，其誘導(dǎo)的特定基因阻斷技術(shù)具有高度的序列特異性。siRNA抑制基因表達(dá)的效率高，且具備高度的序列特異性，可以特異性抑制mRNA序列，達(dá)到阻斷目的蛋白的表達(dá)作用，同時(shí)又具備防止長(zhǎng)鏈dsRNA引發(fā)的非特異性基因降解和細(xì)胞死亡的功能。故siRNA已成為RNAi施展重要作用的中間效應(yīng)分子。

臨床研究［7］證明，HMGA1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，HMGA1基因在甲狀腺癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌、大腸癌、乳腺癌等許多腫瘤中呈高水平表達(dá)，而癌旁正常組織不表達(dá)或微弱表達(dá)，推測(cè)其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。正常細(xì)胞若轉(zhuǎn)染HMGA1基因可導(dǎo)致正常細(xì)胞的惡化，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)HMGA1基因，可導(dǎo)致細(xì)胞惡性程度的增加。研究［9］表明，不管在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物身上的惡性腫瘤或應(yīng)用致癌誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的正常細(xì)胞惡變都可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)HMGA1水平迅速升高；可以設(shè)想，若抑制HMGA1的高表達(dá)，是否可以阻止細(xì)胞的惡化，HMGA1有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究表明人甲狀腺乳頭狀癌組織中有HMGA1蛋白異常表達(dá)，但還有許多關(guān)鍵性問(wèn)題沒(méi)有搞清楚，本課題通過(guò)設(shè)計(jì)并合成HMGA1 siRNA，然后轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，對(duì)照組以等量陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后K1細(xì)胞中HMGA1 mRNA的表達(dá)，HMGA1 mRNA的表達(dá)以PGR循環(huán)數(shù)閾值（Ct值）表示；Western blot法測(cè)定K1細(xì)胞中HMGA1蛋白的表達(dá)；顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染后存活的K1細(xì)胞數(shù)，篩選出有效的siRNA。用有效的siRNA重新轉(zhuǎn)染K1細(xì)胞，選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGA1 siRNA的甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGA1 siRNA的甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株中HMGA1 mRNA和蛋白的表達(dá)；CCK8、Transwell法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移力。觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGA1 siRNA對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，從而進(jìn)一步了解HMGA1基因在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為甲狀腺乳頭狀癌的治療開(kāi)辟新的途徑。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，制備HMGA1-siRNA基因，并植入甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞，觀察siRNA對(duì)HMGA1基因表達(dá)的影響。研究顯示siRNA可以沉默HMGA1基因，減緩甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖。該研究結(jié)果對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的診斷、治療具有一定的啟示意義，有待進(jìn)一步研究。

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Impact on proliferation of K1 cells in papillary thyroid carcinoma under the inhibition of siRNA on HMGA1 gene

Zhou Daxin1，2，Zhou Rui1，Li Dequn1，et al
（1Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Hefei 233004；2Huaibei Clinical Institute of Anhui Medical University，Dept of General Surgery，Huaibei People's Hospital，Huaibei 235100）

Objective To study the effect of HMGA1-siRNA gene on proliferation of K1 cells in papillary thyroid carcinoma.Methods Experimental group was transfected with HMGA1 by small interfering RNA（siRNA）；the negative contrast group was transfected with HMGA1 nonrelevant sequence，and transfected with K1 cells of thyroid papillary carcinoma.The impact on the proliferation of K1 cells after the transfection of HMGA1-siRNA was tested by CCK-8.The HMGA1-mRNA expression in the normal group was tested by RT-PCR.The HMGA1 protein expression in the three groups was tested by Western blot.The invasion of K1 cells transfected with HMGA1-siRNA gene was detected by Transwell invasion assay in three groups.Results The effect of HMGA1-siRNA gene on the proliferation of K1 cells was obvious，which was relevant to time and dosage.The expression of mRNA and protein in K1 cells was significantly lower than that in normal in HMGA1-siRNA cells.The expression of mRNA and protein in K1 cells was significantly lower than that in the normal group and the negative control group.The invasion ability of K1 cells in HMGA1-siRNA group was significantly lower than that in the normal group and the negative control group.Conclusion siRNA can silence HMGA1 gene，and slow down the proliferation of papillary thyroid carcinoma K1 cells.

HMGA1-siRNA gene；papillary thyroid carcinoma；K1 cell；RNA interference technology

R 739.91

A

1000-1492（2016）06-0783-04

2016-04-13接收

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2015B106by）

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，蚌埠 2330042安徽醫(yī)科大學(xué)淮北臨床學(xué)院、淮北市人民醫(yī)院普外科，淮北 235100

周大新，男，碩士研究生；周 銳，男，主治醫(yī)師，碩士，責(zé)任作者，E-mail：zhourui19810120@126.com；李德群，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lidequn8888@163.com