李懿君，李　昊，尹　玉，孫晶璐，江　燕，詹鶴琴，楊　楓，詹　磊

MiR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞侵襲和遷移的影響

李懿君，李昊，尹玉，孫晶璐，江燕，詹鶴琴，楊楓，詹磊

目的 探討微小RNA（miR）-200a的過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。方法 利用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含miR-200a的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組將載有miR-200a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中，細(xì)胞對照組結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞不做任何處理；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法分析miR-200a的表達(dá)變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的改變、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的改變。結(jié)果 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組比較，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后miR-200a的表達(dá)水平顯著升高（P＜0. 01）；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)表明外源性過表達(dá)miR-200a可促進(jìn)結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的遷移和侵襲能力，與細(xì)胞對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論miR-200a能明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的侵襲和遷移。

結(jié)直腸癌；miR-200a；侵襲；遷移

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.014.html

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，常發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移［1］。結(jié)直腸癌的早期癥狀通常很難被發(fā)現(xiàn)，患者確診時(shí)往往已是晚期，已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，甚至轉(zhuǎn)移到了肝臟。發(fā)生了轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的平均生存時(shí)間不到2年［2］，因此，探討結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的原因以及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對結(jié)直腸癌的發(fā)病以及轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)測、診斷和預(yù)后判斷等是結(jié)直腸癌研究的重要內(nèi)容。Michael et al［3］首先報(bào)道m(xù)iRNA（miR）-143與miR-145在結(jié)腸直癌中表達(dá)失調(diào)，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種miR的表達(dá)失調(diào)并參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，某些miR有一定的診斷及預(yù)后價(jià)值［4］。該實(shí)驗(yàn)將載有miR-200a的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中，研究miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞侵襲能力和遷移能力的影響，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑 SW1116人結(jié)直腸癌細(xì)胞系由南京醫(yī)科大學(xué)病理教研室饋贈(zèng)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清和LipofectamineTM2000均購自美國Thermo Fisher Scientific Inc公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；miR提取試劑盒、miR cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR檢測試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；LightCyclerTM480熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司；Transwell小室購自美國Corning Costar公司；Matrigel凝膠購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW1116細(xì)胞）常規(guī)置于含5%滅活胎牛血清、100 μmol/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1～2 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代。之后換為不含抗生素的含5%胎牛血清的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中傳代SW1116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)2×105/ml，接種于6孔板中。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分2組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染5 μg Pgenesil-1-miRNA200a質(zhì)粒）、細(xì)胞對照組。待SW1116細(xì)胞的融合率約90%時(shí)，將載有miR-200a的質(zhì)粒加入250 μl的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，再將10 μl的LipofectamineTM2000與250 μl的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，常溫孵育20 min；之后將這兩種稀釋液溫和混勻，室溫孵育20 min，加入6孔板各孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR法檢測結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中miR-200a基因表達(dá)變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，收集細(xì)胞，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)組中miR-200a的表達(dá)水平，miR-200a以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)作為內(nèi)參照。miR-200a上游引物：5′-CCTACG CACAATTAACAAGCC-3′，下游引物：5′-GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3′，GAPDH上游引物：5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，下游引物：5′-GAGTT-GTCATATTTCTCGTGG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)的條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。分別記錄實(shí)驗(yàn)組和細(xì)胞對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用2-ΔΔCt相對定量法進(jìn)行分析計(jì)算，以衡量miR-200a的表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞遷移能力的影響 用Marker筆在6孔板背后均勻的劃橫線，大約每隔1 cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在6孔板中接種轉(zhuǎn)染后24 h后的各組細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)，用200 μl微量移液槍頭在6孔板內(nèi)垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗3遍，沖洗掉劃痕之間的細(xì)胞，之后加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隨機(jī)選出10個(gè)點(diǎn)，分別于0 h和24 h的時(shí)候在顯微鏡下進(jìn)行拍照。通過計(jì)算劃痕兩邊細(xì)胞遷移的距離來判斷結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的遷移能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞侵襲能力的影響 將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104/ml后接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。50 mg/L的Matrigel用不含血清的培養(yǎng)基1∶8稀釋，在Transwel小室的通透膜上均勻涂50 μl后4℃晾干。將轉(zhuǎn)染后24 h的200 μl的細(xì)胞懸液加入侵襲小室的上室中，并將含5%胎牛血清的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（600 μl）加入到侵襲小室的下室中。之后將小室置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，將Matrigel凝膠和小室通透膜上方的細(xì)胞用棉簽擦去，固定侵襲到小室膜下方的細(xì)胞并用0.1%結(jié)晶紫染色，20 min后，在顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過通透膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)，以穿過膜的細(xì)胞的相對個(gè)數(shù)計(jì)量結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的侵襲能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0以及Excel軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組均數(shù)之間的比較采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)定量PCR法檢測結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中miR-200a的表達(dá) 細(xì)胞對照組和實(shí)驗(yàn)組中miR-200a的表達(dá)分別為（1.0±0.0）、（1 269.6± 441.1），實(shí)驗(yàn)組中miR-200a的表達(dá)水平較細(xì)胞對照組明顯升高（t=12.383，P=0.006）；實(shí)時(shí)定量PCR法檢測表明轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組miR-200a的表達(dá)升高。

2.2miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)后分別于0、24 h時(shí)在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕傷口的寬度，細(xì)胞對照組和實(shí)驗(yàn)組中24 h時(shí)遷移距離的百分比分別為（39.96± 2.64）%、（68.86±4.70）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =6.501，P=0.023）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-200a后SW1116細(xì)胞遷移能力升高，見圖1。

圖1　miR-200a對SW1116細(xì)胞遷移力的影響A：細(xì)胞對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；1：0 h；2：24 h；與細(xì)胞對照組比較：*P＜0.05

2.3miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-200a對SW1116細(xì)胞侵襲能力的影響，細(xì)胞對照組和實(shí)驗(yàn)組中穿過基膜的細(xì)胞數(shù)分別為（100.0± 0.0）個(gè)和（331.33±25.03）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.07，P=0.006）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-200a后SW1116細(xì)胞侵襲能力升高，見圖2。

3　討論

miRNAs是一組長度約為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，對真核生物的基因表達(dá)、細(xì)胞發(fā)育分化和個(gè)體發(fā)育等多方面起調(diào)控作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，也起到非常重要的調(diào)控作用［5］。近年來，miR-200家族在調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展方面受到廣泛關(guān)注，miR-200家族在上皮來源腫瘤（如消化系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等）中扮演的角色也越來越為人們所知。

圖2　miR-200a對SW1116細(xì)胞侵襲力的影響A：細(xì)胞對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；與細(xì)胞對照組比較：**P＜0.01

miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429五個(gè)成員，miR-200家族已經(jīng)被證實(shí)在多種腫瘤中通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤的進(jìn)展。miR-200家族在不同的腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，目前已有研究［6］證明miR-200家族在胃癌中表達(dá)下調(diào)，在正常組織和癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦有研究［7］表明，在奧沙利鉑抵抗的結(jié)直腸癌患者中，miR-200c和miR-141的表達(dá)是下調(diào)的，miR-200c和miR-141則被報(bào)道［8］其表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)ZEB1/2的表達(dá)進(jìn)而推動(dòng)及胃癌的進(jìn)展，miR-200家族在乳腺癌中的低表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。Humphries et al［9］證明miR-200b通過靶向作用于蛋白激酶Cα抑制三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果都表明，miR-200家族在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮著重要作用，扮演著癌基因或者抑癌基因的角色。

然而miR-200a在結(jié)直腸癌中的作用目前仍有爭議，對其浸潤侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究尚少見，為此我們進(jìn)行了這一體外實(shí)驗(yàn)，通過在體外提高miR-200a的表達(dá)水平，探討其對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力的影響。本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定性好、操作簡便的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將載有miR-200a的質(zhì)粒導(dǎo)入SW1116細(xì)胞中，在結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中高表達(dá)miR-200a作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)建立細(xì)胞對照組與之相比較，用實(shí)時(shí)定量PCR法結(jié)果證實(shí)SW1116細(xì)胞中miR-200a的表達(dá)。通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力、Transwell小室法檢驗(yàn)細(xì)胞的侵襲能力，證明miR-200a的高表達(dá)促進(jìn)了SW1116細(xì)胞的遷移和侵襲。說明miR-200a在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，由此推測miR-200a在結(jié)直腸癌的侵襲以及遷移過程中可能發(fā)揮著癌基因的作用。

結(jié)直腸癌是當(dāng)今世界上第三大常見癌癥，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致晚期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較差，然而其具體的調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。因此，深入探索結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可以為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的診斷和治療以及提高患者的生存率提供新思路。miRNAs可以通過其種子序列與靶基因的mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究［10］表明，miR-200a可以通過靶向作用于EGFR以及c-Met進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的遷徙和侵襲，亦有研究［11］報(bào)道m(xù)iR-200a可直接靶向作用于TGFB2，抑制腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，Yang et al［12］發(fā)現(xiàn)miR-200a通過降低ZEB2的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移，說明進(jìn)一步研究miRNAs及預(yù)測其靶基因?qū)τ谘芯科湓诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用有重要意義，而miR-200a在抑制結(jié)直腸癌遷徙和侵襲和作用的靶基因及分子機(jī)制還不明確，因此尋找miR-200a在結(jié)直腸癌中的作用靶點(diǎn)是進(jìn)一步研究的重要內(nèi)容。

miR-200a在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)模式，miR-200a在結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中表達(dá)失常［13］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明miR-200a能促進(jìn)結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞的侵襲和遷移能力，提示miR-200a是一種重要潛在的原癌基因，在促進(jìn)腫瘤增殖生長中起了不可或缺的作用，因此目前臨床上常將其作為在基因水平上治療腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要靶點(diǎn)，是治療腫瘤的關(guān)鍵基因之一。研究［14］表明miR-200a和miR-200b能夠影響姜黃素在肝細(xì)胞癌中的療效，miR-200家族在肝細(xì)胞癌中已經(jīng)成為通用的診斷標(biāo)志，根據(jù)miR-200a在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中所扮演的角色可以為未來開展結(jié)直腸癌治療提供新思路，即通過下調(diào)miR-200a的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

結(jié)合以往的研究、文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，miR-200a與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-200a在人結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，可能是調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵miR之一。這為結(jié)直腸癌臨床基因治療提供了新的思路和理論依據(jù)。然而對于miR-200a還有許多問題需要進(jìn)一步研究，如miR-200a對結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞影響的確切作用機(jī)制及作用途徑，miR-200a與其他和結(jié)直腸癌相關(guān)的基因相互作用的關(guān)系，以及和miR-200a相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是不是能得到相同的結(jié)論等，因此對于miR-200a的研究仍有廣闊的前景和巨大的空間，需要不斷地努力探索和開拓。

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Effect of miR-200a on the migration and invasion of colorectal cancer SW1116 cells

Li Yijun，Li Hao，Yin Yu，et al
（Dept of Pathology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of microRNA（miR）-200a on migration and invasion abilities of colorectal cancer SW1116 cells.Methods miR-200a plasmid was transfected into SW1116 cells in colorectal cancer SW1116 cells by LipofectamineTM2000 as the experimental group，colorectal cancer SW1116 cells in the control group do not do any processing.The expression of miR-200a in the experimental group was confirmed by real-time PCR.The migration abilities of cells were detected by Transwell invasion assay，and the invasion abilities of cells were detected by wound-healing assay.Results Real-time quantitative PCR results showed that compared with the control group，experimental group after transient transfection of miR-200a was significantly increased（P＜0.01）.Exogenous overexpression of miR-200a could promote migration and invasion abilities of SW1116 cells，compared with the control group the difference was statistically significant（P＜0.01）.Conclusion miR-200a can promote the migration and invasion abilities of colorectal cancer SW1116 cells.

colorectal cancer；miR-200a；migration；invasion

R 735.3

A

1000-1492（2016）06-0791-04

2016-04-14接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81201536）；安徽高校省級自然科學(xué)基金（編號：KJ2011A160）

安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

李懿君，女，碩士研究生；李 昊，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lihao3402@aliyun.com；尹 玉，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydyinyu@aliyun.com