申永剛，尹　勝，蔣　森，丁圣剛，呂正梅，沈　兵，杜　鵑

基礎(chǔ)醫(yī)學研究

TRPV4-SKCa在老年大鼠氣管平滑肌中改變及對其收縮的影響

申永剛1，尹勝2，蔣森2，丁圣剛3，呂正梅1，沈兵2，杜鵑2

目的 闡明瞬時受體電位離子通道家族（TRP）中香草素受體亞家族（TRPV）成員TRPV4和小電導(dǎo)鈣激活鉀通道3（SK3）復(fù)合物對老年大鼠氣管平滑肌收縮的影響。方法運用離體氣管張力實驗，觀察高鉀、卡巴膽堿對年輕、老年大鼠氣管收縮的影響，以及瞬時受體電位離子通道TRPV4特異性激動劑和抑制劑對卡巴膽堿引起的氣管收縮的影響；運用Western blot法檢測TRPV4和SK3在年輕、老年大鼠氣管平滑肌上表達量的變化。結(jié)果 與年輕大鼠比較，老年大鼠高鉀引起的氣管收縮沒有顯著改變，但卡巴膽堿引起的收縮顯著增強，且TRPV4激動劑GSK引起的舒張反應(yīng)顯著降低；兩組大鼠用TRPV4阻斷劑HC或RN1734預(yù)處理后，GSK引起的舒張反應(yīng)均被顯著阻斷；Western blot結(jié)果顯示，與年輕大鼠比較，老年大鼠氣管平滑肌組織TRPV4表達顯著升高，SK3表達卻顯著降低。結(jié)論 TRPV4-SK3信號復(fù)合物在老年大鼠氣管平滑肌表達改變可能與老年大鼠氣管舒張效應(yīng)減弱有密切關(guān)系。

瞬時受體電位離子通道香草素受體4；小電導(dǎo)鈣激活鉀通道；老年大鼠；氣管平滑肌

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.002.html

支氣管哮喘在臨床常見、多發(fā)，是一種由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞等）參與的氣道慢性炎癥性疾病，主要特征有氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑［1］。其發(fā)病率、病死率在我國居高不下，且呈逐年上升趨勢。尤其是老年性支氣管哮喘，癥狀更嚴重，對平喘藥物反應(yīng)差，預(yù)后差，病死率高［2］。而TRPV4是瞬時受體電位離子通道家族（transient receptor potential，TRP）中香草素受體亞家族（transient receptor potential vanilloid，TRPV）成員之一，參與氣管平滑肌收縮的調(diào)節(jié)［3］。TRPV4在老年大鼠氣管上的表達與作用的研究尚鮮有報道。該實驗通過闡明TRPV4在老年大鼠氣管平滑肌表達量的改變和對氣管收縮功能的影響，探索老年支氣管哮喘發(fā)病新機制和治療的新方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 卡巴膽堿（carbachol）、GSK1016790A（GSK）、HC067047（HC）和RN1734購自美國Sigma公司；抗TRPV4抗體、抗小電導(dǎo)鈣激活鉀通道三亞型（SK3）抗體和抗β-tubulin抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗羊抗兔IgG購自中國Biosharp公司；克氏液（NaCl 118 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、Mg-SO4·7 H2O 1.2 mmol/L、NaHCO325.2 mmol/L、glucose 11.1 mmol/L）；高鉀溶液（NaCl 58 mmol/L、KCl 60 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgSO4·7 H2O 1.2 mmol/L、NaHCO325.2 mmol/L、glucose 11.1 mmol/L）。

1.1.2實驗動物 昆明種老年大鼠22月齡，年輕大鼠3月齡（清潔級），由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。室溫維持（22±1）°C，正常進食飲水。

1.2方法

1.2.1氣管環(huán)的制備 用CO2窒息法處死大鼠，立即解剖大鼠取出喉部以下的主支氣管，并及時放入提前備好的通有混合氣體（95%O2、5%CO2）的克氏液中。在解剖顯微鏡下，使用眼科剪和手術(shù)鑷盡快輕柔地將氣管外周結(jié)締組織去除干凈，再用粗糙的金屬絲謹慎去除氣管內(nèi)皮，避免損傷氣管。最后沿氣管縱軸將其剪成長約2 mm的氣管環(huán)。

1.2.2離體氣管張力實驗 將氣管環(huán)懸掛于張力換能器上并置于通有混合氣體（95%O2、5%CO2）、含有5 ml克氏液的浴槽內(nèi)；調(diào)節(jié)好BL-420S生物機能信號記錄系統(tǒng)各項參數(shù)，并給予氣管環(huán)1 g前負荷。測定張力信號之前，需要先在克氏液中平衡40～60 min，每隔15 min更換1次克氏液。待基線趨于穩(wěn)定后，用60 mmol/L的高鉀溶液收縮氣管。收縮氣管后，用克氏液沖洗3次，每次3 min，然后再休息30 min。之后加入累積濃度的卡巴膽堿，觀察收縮效應(yīng)；或用1 μmol/L卡巴膽堿預(yù)收縮5 min后，加入不同濃度舒張劑，觀察量效關(guān)系。

1.2.3Western blot實驗 將氣管組織在冰上研磨，采用適當?shù)鞍琢呀庖禾崛〉鞍讟悠?，然?℃離心取上清液，進行SDS-PAGE電泳，再在200 mA恒流下將蛋白從膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別與特異性抗體：抗TRPV4、SK3和β-tubulin內(nèi)參孵育過夜，第2天洗去一抗后再和酶標二抗結(jié)合，經(jīng)過漂洗后加入特異性化學發(fā)光底物顯色液，再曝光并采集圖像。

1.3統(tǒng)計學處理 運用Sigma plot 12.5軟件分析數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果以±s表示，進行t檢驗或多因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1年齡對高鉀溶液引起的氣管收縮的影響 大鼠氣管環(huán)經(jīng)60 mmol/L高鉀激動達最大收縮，見圖1，老年和年輕兩組大鼠氣管環(huán)收縮反應(yīng)差異無統(tǒng)計學意義（t=0.505，P＞0.05）。

圖1　年齡對高鉀溶液引起的大鼠氣管收縮的影響

2.2年齡對卡巴膽堿引起的氣管收縮的影響 待氣管平衡穩(wěn)定后，依次按濃度梯度，累積加入3× 10-7.5～3×10-5mol/L卡巴膽堿，氣管收縮逐次增強，見圖2，與年輕大鼠比較，老年大鼠對卡巴膽堿的收縮反應(yīng)顯著增強（F=5.082，P＜0.05）。

2.3年齡對TRPV4通道激動劑GSK引起的氣管舒張影響 用1 μmol/L卡巴膽堿預(yù)收縮大鼠氣管環(huán)后，按濃度梯度（1×10-10～1×10-8mol/L）累積加入GSK，見圖3。GSK引起的老年大鼠氣管舒張顯著降低（F=4.636，P＜0.05）。

圖2　年齡對卡巴膽堿引起的大鼠氣管收縮的影響與年輕組比較：*P＜0.05

圖3　年齡對TRPV4激動劑GSK引起的大鼠氣管舒張影響與年輕組比較：*P＜0.05

2.4TRPV4通道阻斷劑對GSK引起的氣管舒張效應(yīng)的影響 將氣管環(huán)預(yù)先分別用10 μmol/L HC（圖4A）或10 μmol/L RN1734（圖4B）處理20 min后，用1 μmol/L卡巴膽堿引起氣管收縮，再按照濃度梯度（1×10-10～1×10-8mol/L）累積加入GSK引起氣管舒張，結(jié)果顯示GSK引起的氣管舒張被HC（F=0.474，P＞0.05）和RN1734（F=0.142，P＞0.05）顯著阻斷。

2.5TRPV4和SKCa通道蛋白表達變化 將氣管組織取出后，抽提平滑肌組織蛋白，采用Western blot法檢測TRPV4和SKCa通道蛋白含量，結(jié)果顯示老年大鼠氣管平滑肌組織TRPV4通道蛋白表達顯著升高（t=-2.639，P＜0.05），而SKCa通道第三亞型（SK3）顯著降低（t=4.676，P＜0.05）。見圖5。

圖4　TRPV4通道阻斷劑HC和RN1734對GSK引起的大鼠氣管舒張影響A：HC；B：RN1734

3　討論

TRPV4屬于非選擇性陽離子通道，在多種組織、器官上均有表達，可以將生物體內(nèi)外環(huán)境中的機械力、熱、低滲、剪切力、佛波醇酯衍生物、花生四烯酸等多種理化刺激轉(zhuǎn)化成鈣信號，參與機體的多種生理和病理過程［4-5］。小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（SKCa）是一種鉀離子選擇性離子通道，對鈣離子高度敏感而對電壓沒有依賴特性。哺乳動物SKCa家族包括SK1、SK2和SK3三種亞型，其中SK3在多種器官的平滑肌上表達，參與其收縮功能的調(diào)節(jié)，SK3高表達可引起子宮、支氣管和膀胱等平滑肌收縮功能減弱［6］。

圖5　氣管平滑肌細胞TRPV4和SK3通道蛋白表達變化與年輕組比較：*P＜0.05

支氣管哮喘，簡稱哮喘，是臨床常見病、多發(fā)病，在老年患者中，癥狀更重，預(yù)后更差。哮喘作為老年人的常見疾病之一，高達50%的病死率，但長期以來缺乏足夠的認識。臨床上對老年性哮喘的治療常常忽視了隨著年齡變化而出現(xiàn)的生理結(jié)構(gòu)與功能、藥物代謝及耐受性的改變，使得療效不理想［7］。因此，尋找老年人氣管的結(jié)構(gòu)和功能改變、探索新的治療方法已成為重要的研究課題。

氣管平滑肌的收縮在哮喘的發(fā)病中起著重要作用，其機制與許多離子通道蛋白密切相關(guān)。本課題組前期研究［8-10］顯示TRPV4-SKCa在氣管平滑肌上形成復(fù)合物，負反饋調(diào)節(jié)氣管收縮，通過TRPV4和SKCa相互作用，經(jīng)TRPV4進入氣管平滑肌細胞的鈣離子迅速激活SKCa通道，鉀離子通過SKCa通道外流，導(dǎo)致細胞膜超極化，從而反饋性抑制電壓依賴鈣通道，抑制激動劑引起的Ca2+內(nèi)流和氣管平滑肌收縮，最終導(dǎo)致氣管舒張。在本研究的氣管張力實驗中，與年輕大鼠比較，老年大鼠卡巴膽堿引起的收縮反應(yīng)顯著增強，對TRPV4激動劑GSK引起的舒張效應(yīng)顯著降低，而用TRPV4阻斷劑預(yù)處理后，兩組大鼠GSK引起的舒張作用都被顯著阻斷。結(jié)果提示，老年大鼠TRPV4介導(dǎo)的氣管平滑肌舒張效應(yīng)顯著減弱。而且，Western blot結(jié)果顯示老年大鼠氣管平滑肌TRPV4表達顯著增強，而SK3表達卻顯著降低。由此推測，TRPV4介導(dǎo)的氣管平滑肌舒張效應(yīng)減弱可能是由于其下游信號SK3表達降低所致，而TRPV4表達增強則可能是代償?shù)慕Y(jié)果。因此，TRPV4-SKCa信號復(fù)合物表達的改變對老年性哮喘發(fā)病有重要意義。

綜上所述，SK3在老年大鼠氣管平滑肌上表達顯著減少，導(dǎo)致了TRPV4介導(dǎo)的氣管舒張顯著降低。此發(fā)現(xiàn)可為老年性哮喘的發(fā)病提供新的理論依據(jù)。

［1］ 蔣寶安，屈 斌，鄭 輝，等.支氣管哮喘的發(fā)病機制及藥物治療研究進展［J］.中國當代醫(yī)藥，2015，22（13）：35-7，41.

［2］ 盧晏民.82例老年支氣管哮喘的臨床分析［J］.中國實用醫(yī)藥，2011，6（25）：103-4.

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［4］ 李孝瓊，陳 莉，王昌梅.TRPV4對HeLa細胞增殖的作用［J］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7（7）：2954-6.

［5］ 王艷琴，岳壽偉，郄淑燕.TRPV4離子通道和機械敏感性［J］.中國康復(fù)醫(yī)學雜志，2007，22（6）：559-61.

［6］ 楊微微，湯玉蓉，王 云，等.α受體依賴的雌二醇對大鼠結(jié)腸平滑肌細胞SK3表達的影響［J］.中華醫(yī)學雜志，2013，93（30）：2367-71.

［7］ 李有香.老年哮喘研究的新進展［J］.中國老年學雜志，2011，31（13）：2592-4.

［8］ Jin M，Berrout J，Che L，et al.Hypotonicity-induced TRPV4 function in renal collecting duct cells：modulation by progressive crosstalk with Ca2+-activated K+channels［J］.Cell Calcium，2012，51（2）：131-9.

［9］ Ma X，Du J，Zhang P，et al.Functional role of TRPV4-KCa2.3 signaling in vascular endothelial cells in normal and streptozotocininduced diabetic rats［J］.Hypertension，2013，62（1）：134-9.

［10］張 潔，沈 兵，桑大成，等.14，15-EET通過TRPV4-SKCa復(fù)合物調(diào)節(jié)氣管平滑肌收縮機制研究［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2015，50（5）：565-8.

Change of TRPV4-SKCaexpression and effect on contractile function in aged airway smooth muscle

Shen Yonggang1，Yin Sheng2，Jiang Sen2，et al
（1Dept of Histology and Embryology，2Dept of Physiology，College of Basic Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the functional role of transient receptor potential vanilloid 4（TRPV4）-small conductance Ca2+activated potassium channel 3（SK3）in the contraction of aged rat airway smooth muscle.Methods We used tracheal tension measurement to observe the effect of high K+solution and carbachol on the tracheal contraction and the effect of TRPV4 channel agonist（GSK）and antagonist（HC and RN1734）on carbachol-induced tracheal contraction.Western blot was used to examine the expression level of TRPV4 and SK3.Results Compared with the young rats，high K+solution-induced contraction did not change in the aged rat tracheal rings.However，carbachol-induced contraction was significantly increased.The relaxation induced by GSK was notably reduced in the aged rat tracheal rings.On the other hand，TRPV4 antagonist HC and RN1734 significantly inhibited GSK-induced relaxation.Western blot data showed that the expression level of TRPV4 was markedly increased；but SK3 expression was significantly decreased in the aged rat airway smooth muscle.Conclusion The change of the expression level of TRPV4-SK3 complex may be the reason for the reduction of tracheal relaxation.

transient receptor potential vanilloid 4；small conductance Ca2+activated potassium channel；aged rat；airway smooth muscle

Q 412

A

1000-1492（2016）06-0765-04

2016-02-25接收

國家自然科學基金（編號：81371284）

安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院1組織學與胚胎學教研室、2生理學教研室，合肥 2300323安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

申永剛，男，碩士研究生；呂正梅，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：lvzm99@ 126.com；沈 兵，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：shenbing @ahmu.edu.cn