李文怡，范余娟，徐紅，范江濤，孫丹

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

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人SNCG基因shRNA慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

李文怡，范余娟，徐紅，范江濤，孫丹

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530022)

目的構(gòu)建人SNCG基因短發(fā)夾干擾RNA(shRNA)慢病毒載體質(zhì)粒，并觀察用其轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞SNCG mRNA和蛋白的表達(dá)變化。方法設(shè)計(jì)3種SNCG基因特異性shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3 ,用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000在293T細(xì)胞構(gòu)建成慢病毒載體質(zhì)粒。用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)SNCG mRNA，用Western blot法檢測(cè)SNCG蛋白。結(jié)果利用Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切連接轉(zhuǎn)化后的3組陽性轉(zhuǎn)化子，1%瓊脂糖凝膠電泳，特異條帶與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。Chromas Lite比對(duì)分析基因測(cè)序結(jié)果，鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫一致，表明合成的3對(duì)SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正確。HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒載體質(zhì)粒后SNCG mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了3種SNCG shRNA慢病毒載體質(zhì)粒，用其轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞后可有效沉默SNCG基因表達(dá)。

SNCG基因;短發(fā)夾干擾RNA;慢病毒載體質(zhì)粒；子宮內(nèi)膜癌；基因沉默

synuclein-γ(SNCG)基因又稱為乳腺癌特異性基因-1，是一種致癌基因，它與synuclein家族中的synuclein-α和synuclein-β在基因序列上有較高的同源性[1]。短發(fā)夾干擾RNA(shRNA)以慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞后可以整合到宿主DNA 上發(fā)揮穩(wěn)定持久的干擾效果[2]。SNCG與乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌的關(guān)系已被廣泛研究[3～7]，但有關(guān)SNCG基因與子宮內(nèi)膜癌的研究卻較少。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SNCG基因表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[8，9]。2015年3～10月，我們構(gòu)建了人SNCG基因shRNA 慢病毒載體質(zhì)粒，并用其轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A和Ishikawa細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后上述兩種細(xì)胞SNCG mRNA和蛋白表達(dá)變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1主要材料和試劑 293T 細(xì)胞株和人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、HEC-1-A細(xì)胞株由中國科學(xué)院細(xì)胞研究所提供。慢病毒載體系統(tǒng)(GV112載體、pHelper1.0、pHelper2.0 質(zhì)粒)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自NEB公司。Lipofectamine 2000、TRIzol購自Invitrogen 公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司。熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa公司。兔抗鼠Cx43 抗體和嘌呤霉素溶劑均購自Sigma 公司。

1.2方法

1.2.1SNCG shRNA慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建和序列鑒定根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中人SNCG基因的核苷酸序列(NM_003087), 應(yīng)用Invitrogen 公司的在線RNAi設(shè)計(jì)服務(wù)軟件BLOCK-iT RNAi Designer，設(shè)計(jì)SNCG基因的3對(duì)shRNA干擾靶序列。使用BLAST將其與相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，排除與其他編碼序列同源的序列,最終確定3條干擾靶序列shRNA分別為5′-CCAAGGAGAATGTTGTACA-3′、5′-AAGGAGAATGTTGTACAGA-3′、5′-AGACCAAGGAGAATGTTGT-3′。將3對(duì)寡核苷酸火形成雙鏈，用AgeⅠ與EcoRⅠ雙酶切后用T4DNA連接酶連接GV112載體。將3組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，次日隨機(jī)挑選陽性單克隆菌落，使用GV112 通用引物行PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，行基因測(cè)序，序列無誤后分別命名為SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3。取對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/15 mL，接種于直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行GV112、pHelper 1.0、pHelper 2.0載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3。48 h后收集上清液，濃縮純化，得到SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒載體質(zhì)粒原液，于-80 ℃保存。

1.2.2人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染Ishikawa、HEC-1-A細(xì)胞分別傳代,按2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng) 2 d。每種細(xì)胞設(shè)SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組和對(duì)照組，分別用SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3慢病毒載體質(zhì)粒原液和慢病毒空載體質(zhì)粒原液孵育24 h，轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑為5 μL/mL ploybrene，更換含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，再用含2 μg/mL嘌呤霉素新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。24 h后收集細(xì)胞。對(duì)照組用慢病毒空載體質(zhì)粒原液轉(zhuǎn)染。

1.2.3SNCG mRNA表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法。收集各組細(xì)胞，按TRIzol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA進(jìn)行RT-PCR分析。引物內(nèi)參基因GAPDH上游引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；目的基因SNCG上游引物5′-CAAGAAGGGCTTCTCCATCG-3′，下游引物5′-GGTCACGCTCTGTACAACAT-3′。RT-PCR反應(yīng)體系包括2 μL cDNA、2 μL SYBR Green Supermix 混合染料、0.5 μL濃度為10 μmol/L的PCR上游引物、0.5 μL濃度 10 μmol/L的 PCR下游引物和14 μL去離子水。熒光PCR儀反應(yīng)條件為95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)40～50個(gè)循環(huán)；60～95 ℃繪制溶解曲線。用2-ΔΔCt法計(jì)算各組SNCG mRNA表達(dá)量。SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組SNCG mRNA表達(dá)敲減率=1-SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組SNCGmRNA表達(dá)量/對(duì)照組SNCG mRNA表達(dá)量×100%。

1.2.4SNCG蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blot 法。收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，行SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉TBST 溶液封閉1 h，兔抗鼠Cx43 單克隆抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，鼠抗兔IgG 二抗孵育1 h，按ECL試劑盒顯色，暗室內(nèi)行膠片曝光顯影。使用Gel Proanalyzer 5.0 分析軟件測(cè)算各組SNCG 蛋白條帶灰度與GAPDH條帶灰度的比值，作為各組SNCG蛋白表達(dá)量。各組SNCG蛋白表達(dá)敲減率計(jì)算方法同1.2.3。

2　結(jié)果

2.1SNCG基因shRNA慢病毒載體質(zhì)粒鑒定利用Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切連接轉(zhuǎn)化后的3組陽性轉(zhuǎn)化子，1%瓊脂糖凝膠電泳，特異條帶與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。Chromas Lite(版本2.01)比對(duì)分析基因測(cè)序結(jié)果，鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)一致，表明合成的3對(duì)SNCG shRNA序列SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3插入正確。

2.2轉(zhuǎn)染后各組SNCG mRNA 及蛋白表達(dá)比較SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組Ishikawa、HEC-1-A細(xì)胞SNCG mRNA 及蛋白表達(dá)量見表1。SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組Ishikawa、HEC-1-A細(xì)胞SNCG mRNA 及蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均<0.05。SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組HEC-1-A細(xì)胞SNCG mRNA敲減率均達(dá)到90%以上，其中SNCG-KD1組最高，為98.60%；SNCG蛋白敲減率均達(dá)80%以上，其中SNCG-KD3組最高，為97.90%。SNCG-KD1、SNCG-KD2、SNCG-KD3組Ishikawa細(xì)胞SNCG mRNA敲減率均達(dá)到85%以上，其中SNCG-KD1組最高，為95.30%；SNCG蛋白敲減率均達(dá)75%以上，其中SNCG-KD1組最高，為79.30%。

表1　各組SNCG mRNA 及蛋白表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3　討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的20%～30%。近年來，子宮內(nèi)膜癌在我國的患病率明顯上升且趨于年輕化, 成為嚴(yán)重威脅我國女性健康的生殖道惡性腫瘤。75% 的患者臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)為早期(Ⅰ～Ⅱ期)，與其他部位女性惡性生殖道腫瘤相比預(yù)后較好。但對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)病例，治療效果并不令人十分滿意，且缺乏有效的治療方法供選擇。

近年來許多研究證實(shí)，SNCG基因的過表達(dá)能夠增加多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力及增加腫瘤細(xì)胞對(duì)某些化療藥的耐藥性，并與其臨床預(yù)后有關(guān)[10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中SNCG陽性表達(dá)率明顯增高，且隨著臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及癌組織肌層浸潤深度的增加而增高，SNCG陽性表達(dá)組總體生存率顯著低于陰性表達(dá)組[8，9]。Gupta等[11]發(fā)現(xiàn)SNCG基因可以抑制BubR1基因功能，使得細(xì)胞基因表達(dá)異常，導(dǎo)致腫瘤并促使其惡化。Lu等[12]證實(shí)乳腺癌細(xì)胞SNCG 內(nèi)含子中有兩個(gè)AP1 結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)SNCG 可通過AP-1 途徑促進(jìn)細(xì)胞癌變。近來研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Sp1 在腫瘤組織中的異常表達(dá)和活化，可通過促進(jìn)腫瘤生長因子和血管生成因子的基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控腫瘤的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[13]。在SNCG 基因的啟動(dòng)子上游存在富含GC 序列(-202～-173)的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子Sp1 可以與該區(qū)域特異結(jié)合[14]。Jiang等[15]發(fā)現(xiàn)，SNCG 起著類似熱休克蛋白的分子伴侶功能，SNCG 與熱休克蛋白70 結(jié)合后再與雌激素受體結(jié)合，使雌激素受體與雌激素的親和力大大提高，進(jìn)而參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程。但是,其具體的作用機(jī)制目前還不十分明確。因此, 進(jìn)一步研究SNCG基因功能及其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的作用, 將有助于探討SNCG影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)研究SNCG對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響成為可能。用于目的基因轉(zhuǎn)染的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體[16]。慢病毒載體質(zhì)粒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞型，應(yīng)用較多的來源于HIV-1的病毒載體，載體容量大，有著廣泛的宿主范圍，且可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，能在機(jī)體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)。由于本課題組后續(xù)相關(guān)研究涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)病毒感染效率要求高，因此采用干擾SNCG表達(dá)的shRNA 慢病毒載體質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A、Ishikawa細(xì)胞，以構(gòu)建穩(wěn)定干擾SNCG表達(dá)的人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A、Ishikawa細(xì)胞，從而進(jìn)一步研究SNCG與人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)特性(如生長增殖、裸鼠成瘤、侵襲、遷移等)的相關(guān)性，進(jìn)一步明確SNCG與人子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)在篩選出針對(duì)SNCG的有效序列后，構(gòu)建了干擾SNCG的慢病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定及DNA 測(cè)序，證實(shí)成功構(gòu)建了靶向干擾SNCG 的慢病毒載體質(zhì)粒。將其成功轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-A、Ishikawa，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的3個(gè)慢病毒質(zhì)粒都不同程度抑制SNCG mRNA和蛋白的表達(dá)且效果顯著。本研究成功構(gòu)建了SNCG特異性RNA干擾慢病毒載體質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究沉默SNCG后對(duì)人子宮內(nèi)膜癌惡性進(jìn)展機(jī)制的影響以及子宮內(nèi)膜癌基因治療的研究，提供了穩(wěn)定、高效，可靠的技術(shù)平臺(tái)。

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Construction and identification of shRNA lentivirus vector plasmid of human SNCG gene

LIWenyi,FANWenjuan,XUHong,FANJiangtao,SUNDan

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China)

ObjectiveTo construct short hairpin RNA (shRNA) lentiviral vector plasmid of human SNCG gene and to detect the changes of SNCG mRNA and protein expression in human endometrial carcinoma cells HEC-1-A and Ishikawa after transfection. MethodsThree SNCG gene specific shRNA sequences were designed, which were SNCG-KD1, SNCG-KD2 and SNCG-KD3, respectively. Using Lipofectamine 2000 to construct a lentiviral vector plasmid in 293T cells. Human endometrial carcinoma HEC-1-A and Ishikawa cells were transfected with SNCG-KD1, SNCG-KD2 and SNCG-KD3 lentiviral vector plasmids. Using real-time PCR to detect the expression of SNCG mRNA, and Western blotting to detect SNCG protein expression.ResultsAge I and EcoR I were used to connect the three groups of positive transformation. The specific bands were in agreement with the predicted results by 1% agarose gel electrophoresis. The results of the analysis and identification of Lite Chromas (VERSION 2.01) gene sequencing were in agreement with GeneBank database alignment, which showed that the synthesis of three pairs of shRNA Oligo DNA SNCG sequences SNCG-KD1, SNCG-KD2 and SNCG-KD3 inserted correctly. After the three lentiviral vectors were transfected into HEC-1-A and Ishikawa cells, the expression of SNCG mRNA and protein in HEC-1-A and Ishikawa cells was significantly decreased (P<0.05).ConclusionThree shRNA SNCG lentiviral vector plasmids are successfully constructed and transfected into HEC-1-A and Ishikawa cells, which may effectively knock down the SNCG gene and inhibit the expression of SNCG mRNA and protein in HEC-1-A and Ishikawa cells.

SNCG gene; short hairpin RNA; lentivirus vector plasmid; endometrial carcinoma; gene silencing

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460396)。

李文怡( 1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)槠胀▼D科及婦科腫瘤。E-mail: Yvonneliwy@163.com

簡(jiǎn)介：范余娟(1965-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要研究方向?yàn)槠胀▼D科及婦科腫瘤。E-mail: yjfan530@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.004

R737.33;Q782

A

1002-266X(2016)26-0013-04

2016-05-12)