周靜,楊曉鷗,張夢(mèng)云,李秀華,徐婧,謝亞芹

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院)

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雷米普利對(duì)慢性心衰大鼠腎間質(zhì)纖維化及PDGF-B、CTGF表達(dá)的影響

周靜1,楊曉鷗1,張夢(mèng)云1,李秀華1,徐婧1,謝亞芹2

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院)

目的觀察雷米普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎組織血小板源生長因子B(PDGF-B)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響。方法 將30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)和雷米普利組(C組)各10只。B、C組大鼠通過腎上腹主動(dòng)脈部分縮窄法建立大鼠慢性心力衰竭模型，A組大鼠只分離腎上腹主動(dòng)脈而不結(jié)扎。術(shù)后C組大鼠給予雷米普利1 mg/(kg·d)灌胃，A、B兩組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，常規(guī)喂養(yǎng)4周。取各組大鼠腎組織行HE、Masson染色觀察病理變化，用免疫組化法檢測各組腎臟組織中PDGF-B、CTGF蛋白表達(dá)，用RT-PCR法檢測各組大鼠腎臟組織中PDGF-B、CTGF mRNA表達(dá)。結(jié)果與A組相比, B、C組大鼠腎臟出現(xiàn)明顯纖維化改變，其中C組纖維化病變程度較B組輕。B、C組大鼠PDGF-B、CTFG 蛋白和mRNA表達(dá)均高于A組，且B組高于C組(P均<0.01)。結(jié)論 雷米普利可降低心衰大鼠腎間質(zhì)纖維化程度及腎組織PDGF-B、CTFG表達(dá)。

心力衰竭；雷米普利；腎臟纖維化；血小板源性生長因子；結(jié)締組織生長因子

Effects of ramipril on renal interstitial fibrosis, expression of

PDGF-B and CTGF in rats with chronic heart failure

慢性心力衰竭的發(fā)展過程中多伴有腎臟功能損害，腎臟功能損害又會(huì)加重心力衰竭的程度，并嚴(yán)重影響心衰患者的預(yù)后[1,2]。因此，預(yù)防心衰患者的腎臟損害對(duì)于心衰患者的治療及預(yù)后都有重要的臨床意義。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)已被廣泛用于心臟病的治療[3]，但ACEI延緩心衰大鼠腎臟纖維化進(jìn)程的研究卻很少。大量研究表明, 血小板源性生長因子B(PDGF-B)表達(dá)在腎臟纖維化形成中起重要作用[4]；結(jié)締組織生長因子(CTGF)通過自身或介導(dǎo)其他因子的作用，在腎臟纖維化的形成過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。2014年9月～2016年1月，我們用雷米普利干預(yù)慢性心力衰竭大鼠，觀察其對(duì)心衰大鼠腎間質(zhì)纖維化程度及腎組織纖維化細(xì)胞因子PDGF-B、CTGF表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理實(shí)驗(yàn)對(duì)象為30只雄性SPF級(jí)Wistar 大鼠，10周齡，體質(zhì)量190～210 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將其隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、雷米普利組(C組)，各10只。B、C組大鼠手術(shù)分離腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈后，在腎動(dòng)脈上方約1 cm 處半結(jié)扎腹主動(dòng)脈，而A組分離出腹主動(dòng)脈后不結(jié)扎直接關(guān)腹。30只大鼠在術(shù)后連續(xù)3 d予青霉素20萬單位腹腔注射，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。3周后，與假手術(shù)組相比，B組及C組大鼠開始出現(xiàn)平均尿量減少; 喂養(yǎng)4 周后，B組和C組出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)及食量減少、爪背及尾巴發(fā)紺和水腫等臨床癥狀。以左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg作為心力衰竭成模標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢測B、C組大鼠成功建立慢性心力衰竭模型。然后，C組大鼠給予雷米普利1 mg/(kg·d)，A、B組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均以普通混合飼料分籠喂養(yǎng)，連續(xù)4周。給藥4周后，開腹取出大鼠的左側(cè)腎臟組織3份待測。

1.2腎間質(zhì)纖維化觀測方法取各組大鼠腎組織HE染色行腎組織形態(tài)學(xué)觀察。行Masson染色觀察腎組織膠原沉積情況，藍(lán)綠色染為陽性表現(xiàn)，每組隨機(jī)選取10張切片，每張切片取4 個(gè)不同視野，計(jì)算陽性染色面積與整個(gè)視野面積的比值，取平均值，為相對(duì)間質(zhì)容積。

1.3腎組織PDGF-B、CTGF蛋白表達(dá)檢測方法采用免疫組化法。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性表現(xiàn)為棕黃色染色。各組隨機(jī)選取10張切片，每張切片取4個(gè)視野，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組陽性染色面積，結(jié)果以像素單位表示。

1.4腎組織PDGF-B、CTGF mRNA檢測方法采用RT-PCR法。提取腎臟組織中總RNA ，并檢測總RNA的濃度和純度。取2 μg 總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PDGF-B上游引物5′-CTGAGCTGGACTTGAACATGA-3′，PDGF-B下游引物5′-CACTACTGTCTCACACTTGCAGG-3′，擴(kuò)增片斷長度380 bp,退火溫度60 ℃；CTGF上游引物5′-CTGTTCTAAGACCTGTGGGATGG-3′，下游引物5′-GTCCCTTACTCCCTGGCTTTACG-3′，擴(kuò)增片斷長度445 bp，退火溫度56 ℃；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游引物5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′；擴(kuò)增片斷長度452 bp,退火溫度58 ℃。 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0．5 mg/L Goldview)，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，采用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參照，各組腎組織PDGF-B、CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量用目的條帶灰度值和內(nèi)參照條帶灰度值之比表示。

2　結(jié)果

2.1各組腎臟形態(tài)學(xué)改變比較HE染色可見A組大鼠腎臟形態(tài)正常,B組大鼠腎小球、腎小管和腎間質(zhì)均有大量膠原纖維沉積，腎小管明顯擴(kuò)張,間質(zhì)增厚。C組大鼠的腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管及間質(zhì)內(nèi)可見微量膠原纖維沉積。Masson染色可見A組大鼠腎小管間質(zhì)無明顯藍(lán)綠色染膠原纖維；B組大鼠腎小管間質(zhì)可見明顯綠染的膠原纖維；C組大鼠腎小管間質(zhì)的藍(lán)綠色染色程度輕于B組而重于A組。對(duì)Masson 染色進(jìn)行膠原半定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C組的相對(duì)間質(zhì)容積為11.57%±0.82%，高于A組的3.97%±0.32%，低于B組的33.80%±2.54%，P均<0.01。

2.2各組腎組織PDGF-B、CTFG蛋白表達(dá)比較 PDGF-B免疫組化染色A組大鼠腎小管細(xì)胞、腎小球細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量棕黃色染色，為弱陽性；B組大鼠黃染程度明顯強(qiáng)于其他兩組；C組大鼠腎組織的黃染程度重于A組，而輕于B組。三組大鼠腎組織PDGF-B陽性染色面積見表1。CTGF免疫組化染色A組大鼠腎小管內(nèi)可見極少量棕黃色染色，呈弱陽性；B組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)區(qū)可見大量黃染區(qū)，呈強(qiáng)陽性；C組大鼠僅腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見少量黃染區(qū)，呈陽性，其黃染程度比B組大鼠輕。三組大鼠腎組織CTGF陽性染色面積見表1。

2.3各組腎組織PDGF-B、CTFG mRNA表達(dá)比較三組大鼠腎組織PDGF-B、CTFG mRNA表達(dá)見表1。

表1　各組大鼠腎組織中CTGF和PDGF-B蛋白及基因表達(dá)量的比較 ±s)

注：與A組比較，*P<0.01；與B組比較，#P<0.01。

3　討論

本研究結(jié)果顯示，B組大鼠腎組織纖維化程度明顯重于A組，說明慢性心力衰竭會(huì)導(dǎo)致腎臟纖維化。其機(jī)制為慢性心力衰竭后，腎灌注急劇減少，從而激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，使血管緊張素(Ang)Ⅱ水平升高。一方面，AngⅡ可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、CTGF、PDGF等促纖維化因子合成，三者相互作用從而引起或加重腎纖維化[6,7]；另一方面，Ang Ⅱ通過激活NADPH氧化酶產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧又作為Ang Ⅱ的信號(hào)分子介導(dǎo)Ang Ⅱ的致纖維化作用，造成腎間質(zhì)纖維化[8]。本研究B組大鼠腎組織PDGF-B和CTGF的表達(dá)量明顯高于A組，證實(shí)PDGF-B和CTGF與腎臟纖維化密切相關(guān)。PDGF-B具有化學(xué)激活、致增生和硬化等作用，主要通過激活腎固有細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腎小管和間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚，激活其他致腎臟纖維化因子，促進(jìn)ECM積聚和抑制ECM降解等機(jī)制導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化形成[10，11]。CTGF是促纖維化和ECM積聚的重要細(xì)胞因子，也是介導(dǎo)TGF-β1誘發(fā)腎間質(zhì)纖維化的重要效應(yīng)因子[12，13]。通過多種途徑參與ECM的積聚，進(jìn)而加重腎臟纖維化的程度。

本研究C組大鼠腎組織纖維化程度和PDGF-B、CTGF表達(dá)均低于B組，表明雷米普利能通過下調(diào)細(xì)胞因子PDGF-B、CTGF的表達(dá)來延緩腎臟纖維化的進(jìn)程。雷米普利是新一代強(qiáng)效和長效ACEI,有非降壓依賴性腎保護(hù)作用,雷米普利通過競爭性抑制血管緊張素酶，阻斷Ang Ⅰ向AngⅡ的轉(zhuǎn)化，從而顯著減少AngⅡ的生成，進(jìn)而下調(diào)TGF-β1、CTGF、PDGF等一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，減少腎組織中Ⅰ～Ⅲ型膠原沉積，對(duì)腎纖維化起到抑制作用[14～15]。此外雷米普利還可以通過減少腎素的分泌，阻止腎臟纖維化的發(fā)展。綜上所述，心力衰竭患者如早期應(yīng)用雷米普利，能有效抑制腎臟纖維化的進(jìn)展，從而對(duì)腎臟進(jìn)行保護(hù)，最終達(dá)到減輕心衰患者的痛苦，改善患者預(yù)后的目的。

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ZHOUJing1,YANGXiaoou,ZHANGMengyun,LIXiuhua,XUJing,XIEYaqin

(1ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

ObjectiveTo observe the effects of ramipril on the renal interstitial fibrosis, expression of platelet derived growth factor (PDGF-B) and connective tissue growth factor (CTGF) in the renal tissues of rats with chronic heart failure. MethodsThe 30 male Wistar rats were randomly divided into the Sham group (group A, 10 rats), model group (group B,10 rats) and the ramipril group (group C,10 rats). The chronic heart failure model was established by the renal upper abdominal aorta coarctation. After the model was successfully established, the rats in the group C were administrated with 1 mg/(kg·d) ramipril for 4 weeks, while rats in groups A and B were administrated with normal saline for 4 weeks. The degree of renal fibrosis was detected under light microscope by HE and Masson staining. The protein and mRNA expression levels of PDGF-B and CTGF were respectively detected by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsCompared with group A, the renal fibrosis was significantly found in the groups B and C, and group B was more severe than the group C. The protein and mRNA expression levels of PDGF-B and CTGF were significantly higher in the groups B and C than that those of group A, and moreover, group B was higher than group C (allP<0.01). ConclusionRamipril can effectively decrease the renal interstitial fibrosis, expression levels of PDGF-B and CTGF in rats with chronic heart failure.

heart failure; ramipril; renal fibrosis; platelet-derived growth factor; connective tissue growth factor

河北省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(20110180)。

周靜(1991-),女,碩士研究生,主要研究方向?yàn)槁孕牧λソ叩牟±砩?。E-mail: 285738956@qq.com

簡介：李秀華(1967-) ,女,博士,副主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)槔夏晷难?病、老年心力衰竭的診治及病理生理。E-mail: lixiuhua76@ 126. com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.003

R692.5

A

1002-266X(2016)26-0010-03

2016-02-13)