陳妍，王婧，徐旖旎，洪端陽，潘迪，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550025)

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他莫昔芬對乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力、MMP-9活性和表達(dá)的影響及機(jī)制

陳妍，王婧，徐旖旎，洪端陽，潘迪，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550025)

目的觀察他莫昔芬(TAM)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)活性、MMP-9蛋白表達(dá)、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，并探討抑制G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)對上述作用的影響。方法 取對數(shù)生長期乳腺癌MCF-7細(xì)胞，用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h耗竭內(nèi)源性雌激素。將MCF-7細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞貼壁后分為對照組、TAM組和TAM+G15(GPR30選擇性抑制劑)組。對照組用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。TAM組用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，TAM+G15組先用含1 μmol/L的G15的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min，然后用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞侵襲能力，用明膠酶譜法檢測MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-9活性,用Western blot法檢測MCF-7細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，TAM組MCF-7細(xì)胞侵襲能力升高，MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)增加，培養(yǎng)液上清MMP-9活性升高(P均<0. 05)。與TAM組相比，TAM+G15組上述指標(biāo)均降低(P均<0. 05)。結(jié)論TAM可增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，上調(diào)MMP-9的活性及表達(dá)水平。用GPR30選擇性抑制劑G15抑制GR30通路可以抑制這一作用。

他莫昔芬；乳腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶9;G蛋白偶聯(lián)受體30

他莫昔芬(TAM)屬于雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)，通過與雌激素競爭靶細(xì)胞胞質(zhì)中的雌激素受體(ER)α，抑制ERα功能，發(fā)揮拮抗雌激素的作用，是ERα陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的首選藥物。該藥能夠顯著減低ERα陽性乳腺癌患者的病死率，但僅有部分患者能從治療中獲益[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道，G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)與TAM長期使用后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，其中細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解是其關(guān)鍵步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶[4]。MMPs家族中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中最重要的蛋白水解酶之一[5]。2014年6月～2015年9月，我們以ERα和GPR30陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對象，觀察TAM對MCF-9細(xì)胞侵襲能力及MMP-9活性和表達(dá)的影響，以及GPR30選擇性抑制劑G15對上述作用的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料高糖DMEM培養(yǎng)基、無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；DMSO培養(yǎng)基、TAM、明膠均購自Sigma公司；MMP-9抗體、GAPDH抗體為Bio-world公司產(chǎn)品；BCA試劑盒購自Pierce公司；ECL曝光液為Millipore公司產(chǎn)品；羊抗小鼠或羊抗兔IgG 辣根過氧化物酶(HRP)抗體購自Santa Cruz公司；GPR30特異性拮抗劑G15為Cayman Chemical公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。儀器中CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品。制膠、電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)，CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)采用高糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素)，培養(yǎng)條件為37 ℃及體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3分組及給藥方法取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞。給藥前改用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h耗竭細(xì)胞內(nèi)源性雌激素。將MCF-7細(xì)胞接種到6孔板中，過夜，待細(xì)胞貼壁。設(shè)對照組、TAM組和TAM+G15組。對照組用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。TAM組用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，TAM+G15組先用含1 μmol/L G15的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min，然后用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每組5個(gè)復(fù)孔。

1.4MCF-9細(xì)胞侵襲能力觀察采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。按照文獻(xiàn)[6]操作。各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力用各組穿過Matrigel 膠微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)與空白對照穿過Matrigel 膠微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)之比表示。

1.5MCF-7細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)觀察采用Western blot法。收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃、14 000 g離心20 min后取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后按每個(gè)泳道30 μg的蛋白總量上樣，SDS-PAGE電泳，全濕電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。用質(zhì)量濃度為5%的脫脂奶粉于37 ℃ 振搖1 h 進(jìn)行封閉。分別加入MMP-9或GAPDH一抗，37 ℃ 振搖1 h，4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗37 ℃振搖1 h后，采用ECL曝光液進(jìn)行曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，采用Image Lab軟件分析圖像獲得各組MMP-9相對表達(dá)量。

1.6MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)觀察采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集各組細(xì)胞。按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)引物，MMP-9的上游引物為5′-GTGGGGATTTACATGGCACT-3′，下游引物為5′-AAAGCCTATTTCTGCCAGGAC-3′；β-actin上游引物為5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物為5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。按PCR試劑盒的說明書在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參照按照2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-9 mRNA相對表達(dá)量。

1.7MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-9活性觀察采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)。收集各組培養(yǎng)液上清液。將明膠加入SDS-PAGE分離膠液中，使明膠的濃度為0.1%，加入各組培養(yǎng)液上清液后電泳。電泳結(jié)束后，將丙烯酰胺凝膠進(jìn)行復(fù)性、孵育染色和洗脫至負(fù)染條帶清楚。采用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，并用Image Lab軟件分析圖像，計(jì)算各組MMP-9活性，以各組MMP-9條帶與空白對照條帶灰度值之比表示MMP-9活性。

2　結(jié)果

2.1各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力比較對照組、TAM組、TAM+G15組MCF-7細(xì)胞侵襲能力分別為100%±0.3%、201.4%±16.7%、125.2%±17.9%，TAM組MCF-7細(xì)胞侵襲能力高于對照組和TAM+G15組(P均<0.05)，TAM+G15組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2各組MCF-7細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)比較對照組、TAM組、TAM+G15組MCF-7細(xì)胞MMP-9蛋白相對表達(dá)量分別為100%±0.1%、232.5%±27.5%、127.5%±12.5%，TAM組MCF-7細(xì)胞MMP-9蛋白相對表達(dá)量高于對照組和TAM+G15組(P均<0. 05)，TAM+G15組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3各組MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)比較對照組、TAM組、TAM+G15組MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA相對表達(dá)量分別為1.0±0.1、1.94±0.08、1.06±0.14，TAM組MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA相對表達(dá)量高于對照組和TAM+G15組(P均<0.05)，TAM+G15組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4各組MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-9活性比較對照組、TAM組、TAM+G15組MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-9的活性分別為100%±0.2%、253.3%±30.9%、93.0%±12.4%，TAM組MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)液上清MMP-9活性高于對照組和TAM+G15組(P均<0.05)，TAM+G15組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

雌激素在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。最初的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過經(jīng)典的雌激素受體ERα和ERβ來發(fā)揮效應(yīng)。ERα在雌激素發(fā)揮生理作用的各個(gè)過程中都有參與，故學(xué)者們研發(fā)了多種干預(yù)ERα的內(nèi)分泌治療藥物，如ER調(diào)節(jié)劑TAM和ER拮抗劑氟維司群(ICI)。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TAM也可發(fā)揮類似雌激素的作用。TAM的活性代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬(OHT)與雌激素作用類似，能夠促進(jìn)ERα陰性乳腺癌SR-BR-3細(xì)胞的增殖[7]，并增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和KLE細(xì)胞的增殖和侵襲能力[8]。本研究結(jié)果顯示，TAM能夠增強(qiáng)ERα陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，提高其MMP-9蛋白、mRNA的表達(dá)和活性。提示僅僅通過抑制ERα功能來治療乳腺癌可能存在一定的局限性，乳腺癌的治療還需要尋找和發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)。

GPR30是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型雌激素受體，它與經(jīng)典的ERα沒有同源性，效應(yīng)和作用機(jī)制也有所不同，主要介導(dǎo)雌激素快速非基因效應(yīng)[9]。GPR30與乳腺癌的發(fā)生及其生物學(xué)行為有一定程度的相關(guān)性。在侵襲性乳腺癌組織中GPR30過表達(dá)[10]，并且GPR30表達(dá)與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[11]。在GPR30敲除的自發(fā)性乳腺癌MMTV-PyMT小鼠中，乳腺癌轉(zhuǎn)移率顯著下降[12]。這些研究表明，GPR30可能是乳腺癌治療的又一靶點(diǎn)。TAM和ICI雖然能夠抑制ERα功能，但卻能夠激活GPR30。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OHT能夠通過GPR30介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)剪切形成小分子片段發(fā)揮類似雌激素的作用，而小分子cyclin E的形成提示乳腺癌預(yù)后不良[13]。此外，雌激素和ICI都能夠通過GPR30促進(jìn)乳腺癌MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞與胞外基質(zhì)黏附以及鈣蛋白酶1的激活[14]。提示激活GPR30通路可能是TAM或ICI這類內(nèi)分泌治療藥物發(fā)揮類似雌激素作用的機(jī)制之一。

卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫和上皮性卵巢癌中GPR30和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)[15, 16]。雌激素和GPR30選擇性激動(dòng)劑G1能夠上調(diào)卵巢癌 OVCAR5細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)和水解能力，采用siRNA沉默GPR30的表達(dá)或者采用G蛋白的抑制劑百日咳毒素抑制GPR30的活性可阻斷雌激素和G1的這一效應(yīng)[17]。這說明GPR30可能調(diào)控MMP-9的活性和表達(dá)。在本研究中，采用GPR30的特異性抑制劑G15預(yù)處理MCF-7細(xì)胞后，TAM增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的侵襲能力、上調(diào)MMP-9的活性和表達(dá)的作用均被抑制，這提示抑制GPR30的作用可能是阻礙TAM發(fā)揮類似雌激素效應(yīng)的途徑之一。這也提示在乳腺癌內(nèi)分泌治療中除用TAM阻斷ERα信號通路以外，可能還需抑制GPR30信號通路。

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Effects of tamoxifen on invasion, activity and expression of MMP-9 in breast cancer MCF-7 cells

CHENYan,WANGJing,XUYini,HONGDuanyang,PANDi,SHENXiangchun

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

Objective To explore the effects of tamoxifen (TAM) on the invasion, activity and expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in breast cancer MCF-7 cells, meanwhile to discuss the role of inhibiting G-protein-coupled receptor 30 (GPR30) in these effects. Methods MCF-7 cells in the logarithmic phase were pre-cultured for 24 h in phenol red (PR)-free medium without serum to remove endogenous estrogen before the indicated treatments. MCF-7 cells were seeded in the six-well plates and incubated over night to let them adhere on the plate. The control group was continued to cultivate in PR-free medium without serum for 24 h. The TAM group was treated with 1 μmol/L TAM in PR-free medium without serum for 24 h. And the TAM+G15 group was pretreated with G15 (1 μmol/L) for 30 min before treatment with TAM (1 μmol/L) for 24 h in PR-free medium without serum. After treatment, cell invasion was detected by Transwell assay. The activity of MMP-9 in culture medium was tested by Gelatin zymography assay. The MMP-9 protein expression was analyzed by Western blotting. The mRNA expression of MMP-9 was tested by real-time RT-PCR. Results Compared with control group, the cell invasion was increased, the protein and mRNA expression level of MMP-9 was up-regulated, and the activity of MMP-9 in MCF-7 cells was increased in the TAM group (allP<0.05). Furthermore, compared with the TAM group, the above indexes of the TAM+G15 group were all decreased (allP<0.05).Conclusions TAM promotes the cell invasion ability and up-regulates the activity and expression of MMP-9. Meanwhile, the effects may be suppressed by G15 pretreatment.

tamoxifen; breast carcinoma; G-protein-coupled receptor 30; matrix metalloproteinase-9

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302804)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合J字20142007號)；貴州省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(黔教合KY字2015492)；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題(20141001)。

陳妍(1985-)，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥物藥理。E-mail: s0710189@sina.com

簡介：沈祥春(1973-)，男，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幓钚?。E-mail: shenxiangchun@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.26.002

R737.9

A

1002-266X(2016)26-0006-04

2016-05-11)