屈艷霞，陳桂蘭，唐　盈，江　帆，左連東，辜俊梅，李志華

廣州市非缺失型α-地貧基因診斷和產(chǎn)前診斷結(jié)果分析

屈艷霞1，陳桂蘭1，唐盈1，江帆1，左連東1，辜俊梅2，李志華3

（1. 廣 州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623；2. 番禺區(qū)人口和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)站，廣東廣州 518000；3. 廣 州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東廣州510150）

目的： 分析廣州市非缺失型α-地中海貧血(α-地貧)的臨床特征、基因突變類型及構(gòu)成比，為臨床遺傳咨詢提供依據(jù)。方法：259例受檢者均進(jìn)行血液常規(guī)和高效液相色譜分析(HPLC)，篩查陽(yáng)性者采用跨越斷裂點(diǎn)PCR(Gap-PCR)和PCR結(jié)合反向雜交(PCR-RDB)技術(shù)進(jìn)行α-地貧基因分析。夫婦為同型α-地貧攜帶者進(jìn)一步行胎兒α-地貧基因診斷，產(chǎn)后隨防。結(jié)果：259例受檢者中，ααQS/αα 170例、ααWS/αα 43例、ααCS/αα 34例、--SEA/ααQS6例、--SEA/ααCS4例、-α3.7/ααQS1例、-α4.2/ααQS1例。同性別的患者3種非缺失型α-地貧紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而血紅蛋白(HGB)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)產(chǎn)前基因診斷檢出非缺失型HbH(--SEA/ααT)病胎兒5例，胎兒引產(chǎn)后留臍血進(jìn)行復(fù)核，均與產(chǎn)前基因診斷結(jié)果一致。結(jié)論：廣州市非缺失型α-地貧發(fā)生率高，以ααQS/αα最常見，對(duì)疑似非缺失型α-地貧攜帶者進(jìn)行基因檢測(cè)，可顯著降低非缺失型HbH病患兒的發(fā)生率。

非缺失型α-地貧；突變；基因診斷；產(chǎn)前診斷

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To explore the gene mutation types and proportions of non-deletion αthalassemia，and to provide clinical basis for genetic counselling. METHODS：The gene mutation types and frequencies of 259 suspected non-deletion α-thalassemia patients were analyzed by Gap-PCR and PCR-RDB. 30 pregnant women whose husband had the same type of thalassemia received thalassemia prenatal diagnosis. We completed follow-up works. RESULTS：Among the 259 cases，170 cases of ααQS/αα，43 cases of ααWS/αα，34 cases of ααCS/αα，6 cases of --SEA/ααQS，4 cases of --SEA/ααCS，one case of -α3.7/ααQS，and one case of -α4.2/ααQSwere found. Compared with normal control group，there were statistical significances in MCV，MCH in different types of non-deletion α-thalassemia (P＜0.05). 5 fetuses with non-deletion HbH disease were confirmed by prenatal diagnosis. The results of postpartum follow-up were consistent with prenatal diagnoses. CONCLUSION：Guangzhou is a high incidence area of non-deletion α-thalassemia. The most common genotype is ααQS/αα. To reduce the birth of children with non-deletion HbH disease，non-deletion thalassemia genotype carriers s hould be t ested.

【KEY WORDS】non-deletion α-thalassemia；mutation；gene diagnosis；prenatal diagnosis

α-地中海貧血(α-地貧)是一種遺傳性溶血性疾病，由α-珠蛋白基因缺陷所致。根據(jù)其基因改變類型的不同，可分為缺失型α-地貧和非缺失型α-地貧，前者是由于α-珠蛋白基因大片段缺失所致，是主要的變異類型；后者是由于α-珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)序列發(fā)生點(diǎn)突變(包括單堿基置換和一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的缺失或插入)造成的。α-地貧具有高度的遺傳異質(zhì)性，其分子缺陷具有某種程度的種族特異性[1-2]。為了初步了解廣州市非缺失型α-地貧的臨床及血液學(xué)特點(diǎn)，基因突變類型和構(gòu)成比，為地貧的遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷提供臨床參考，以降低患兒出生，現(xiàn)將廣州市259例常見非缺失型α-地貧的基因檢測(cè)情況進(jìn)行匯報(bào)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2007年9月至2013年2月完成篩查和產(chǎn)前診斷，2014年10月完成隨訪，來自于廣州市黃埔區(qū)、番禺區(qū)、增城區(qū)、天河區(qū)參加出生缺陷干預(yù)工程的已孕夫婦259例，男性年齡23～39歲，平均(28.35±3.62)歲；女性年齡21～35歲，平均(26.22±3.40)歲。所有受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1地貧篩查抽取受檢者空腹外周靜脈血2～4 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，應(yīng)用五分類全自動(dòng)血常規(guī)分析儀進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)，參照《血紅蛋白病實(shí)驗(yàn)室診斷指南》[3-4]，即紅細(xì)胞指標(biāo)測(cè)定用于地貧初篩，高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography， HPLC)用于α-地貧和β-地貧的分型。1.2.2 基因型鑒定以DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)和/或磁珠法全血DNA自動(dòng)提取試劑(DNA自動(dòng)提取儀配套試劑，廈門百維信生物科技有限公司)提取基因組DNA。采用跨越斷裂點(diǎn)PCR (gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)技術(shù)檢測(cè)3種缺失型α-地貧基因突變類型(--SEA、-α3.7和-α4.2)，采用PCR結(jié)合反向雜交(PCR-reverse dot blot，PCR-RDB)技術(shù)檢測(cè)非缺失型α-地貧基因3種常見突變類型(αCS，αQS和αWS)，所有地貧基因診斷試劑盒均購(gòu)于深圳益生堂生物技術(shù)有限公司，具體操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3 產(chǎn)前基因診斷對(duì)于一方為東南亞缺失型α-地貧(--SEA/αα)攜帶者，或夫妻雙方同為非缺失型α-地貧攜帶者的孕婦，在其知情同意下轉(zhuǎn)診至廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院。孕婦于術(shù)前進(jìn)行遺傳咨詢，簽署產(chǎn)前診斷相關(guān)術(shù)前知情同意書。在B超引導(dǎo)下，經(jīng)孕婦腹壁行羊膜腔穿刺抽取羊水15 mL(孕18周～24周)，進(jìn)行胎兒地貧基因診斷。

1.2.4隨訪根據(jù)胎兒地貧基因診斷結(jié)果，對(duì)所有受檢者進(jìn)行優(yōu)生咨詢和指導(dǎo)。隨訪所有受檢者的妊娠結(jié)局，并于產(chǎn)后3～12個(gè)月對(duì)新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，以α= 0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1非缺失型α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果

259例受檢者中，ααQS/αα最為常見，占65.64%，見表1。其中1對(duì)夫婦同為ααQS/αα攜帶者，1對(duì)夫婦分別攜帶ααQS/αα和ααCS/αα，28例(其中ααQS/αα 13例，ααWS/αα 7例，ααCS/αα 8例)一方為東南亞缺失型α-地貧(--SEA/αα)攜帶者。

表1　259例非缺失α-地貧基因檢測(cè)結(jié)果

2.2血液學(xué)指標(biāo)

3種常見非缺失α-地貧的血常規(guī)初篩結(jié)果見表2和表3。男、女4組(對(duì)照組、ααQS/αα組、ααWS/αα組和ααCS/αα組)血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)均值之間分別進(jìn)行比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；男、女3種非缺失突變組(ααQS/αα組、ααWS/αα組和ααCS/αα組)之間比較，MCV、MCH均值的差別均有統(tǒng)計(jì)意義(P均＜0.05)，而HGB均值的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3產(chǎn)前基因診斷結(jié)果

夫妻雙方同為非缺失α-地貧攜帶者，或一方為非缺失α-地貧攜帶者，另一方為東南亞缺失型地貧攜帶者的30個(gè)家庭，均選擇進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷，結(jié)果見表4。

2.4隨訪結(jié)果

5例經(jīng)產(chǎn)前診斷確診為非缺失型HbH(--SEA/ααT)病的孕婦，在知情同意下選擇了終止妊娠，其余25例選擇了繼續(xù)妊娠。胎兒引產(chǎn)或出生后留臍血進(jìn)行復(fù)核，均與產(chǎn)前基因診斷結(jié)果一致。

3　討論

非缺失型α-地貧是由于α珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)序列發(fā)生點(diǎn)突變、少數(shù)幾個(gè)核苷酸的缺失或插入而引起(以αT表示累及的基因)。非缺失型a-地貧的基因型，目前已報(bào)道80余種，大多數(shù)的突變位于α2基因內(nèi)[5]。很多非缺失型α-地貧突變會(huì)影響mRNA的加工、翻譯以及合成的α-珠蛋白的穩(wěn)定性[6]。發(fā)生非缺失型α-地貧突變會(huì)讓?duì)?珠蛋白鏈合成量減少，而且比缺失型的減少更明顯，從而使α-鏈/β-鏈比例失衡，引起溶血。

表2　3種常見非缺失α-地貧的血液學(xué)指標(biāo)情況

表3　--SEA/ααT及-α/ααT的血液學(xué)指標(biāo)情況

表4　30例胎兒地貧基因結(jié)果

從血液學(xué)指標(biāo)來看，非缺失型α-地貧雜合子多無臨床表現(xiàn)，HGB、MCV、MCH的值正?；蜉p度下降，表現(xiàn)為靜止型α-地貧，初篩易漏診。本文中男、女4組(對(duì)照組、ααQS/αα組、ααWS/αα組和ααCS/αα組)HGB、MCV、MCH均值之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)；男、女3種非缺失型α-地貧雜合子組(ααQS/αα組、ααWS/αα組和ααCS/αα組)之間比較，MCV、MCH均值之間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，HGB均值之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ααQS/αα攜帶者的血液學(xué)表型相對(duì)較重些，該結(jié)果與以往報(bào)道[6-7]的結(jié)果基本一致。

從基因突變類型來看，廣州地區(qū)最常見的非缺失型α-地貧基因突變類型是ααQS/αα(65.64%)，其次是ααWS/αα(16.60%)和ααCS/αα(13.13%)，基因突變類型構(gòu)成比與既往文獻(xiàn)[8]報(bào)道的以ααCS/αα常見有較大差異。該檢測(cè)結(jié)果表明非缺失型α-地貧基因突變構(gòu)成比存在有很大差別。

HbH病有兩種常見類型：缺失型 HbH病和非缺失型 HbH病。由于非缺失型突變絕大多數(shù)位于功能較強(qiáng)的α2基因，比缺失型導(dǎo)致更嚴(yán)重的α-珠蛋白鏈合成減少，因此非缺失型HbH病的臨床表現(xiàn)和血液學(xué)改變均比缺失型HbH(--SEA/-α)病嚴(yán)重[9]。非缺失型HbH病患者的臨床表現(xiàn)差異大[1，6-7，10]。患者有不同程度貧血，有的終生穩(wěn)定，有的合并生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、黃疸、肝脾腫大、膽結(jié)石等嚴(yán)重的并發(fā)癥，部分患者需要定期輸血治療。此外，還有ααQS/ααQS、ααCS/ααCS、--SEA/ααQS等引起胎兒水腫綜合征的報(bào)道[11-12]。因此，在東南亞缺失型α-地貧攜帶率高的地區(qū)，當(dāng)夫妻一方為--/αα?xí)r，另一方就應(yīng)進(jìn)行基因診斷，以排除為非缺失型α-地貧攜帶者，尤其是后者血液學(xué)表型陽(yáng)性而常見缺失型α-地貧基因和β-地貧基因未檢測(cè)到突變時(shí)，更應(yīng)該考慮對(duì)非缺失型α-地貧基因檢測(cè)。如果配偶為非缺失型α-地貧基因攜帶者，則他們的子女有25%機(jī)率為HbH (--SEA/ααT)病。

本文259例受檢者中，2對(duì)夫婦均為非缺失型α-地貧基因攜帶者，28例另一方為東南亞缺失型α-地貧攜帶者。此30例孕婦均在知情同意下，選擇了產(chǎn)前基因診斷，其中12例胎兒完全正常，13例為輕型地貧，5例為非缺失型HbH病。對(duì)所有受檢者進(jìn)行了遺傳咨詢，非缺失型HbH病胎兒的孕婦均知情同意選擇了終止妊娠。對(duì)所有受檢者進(jìn)行妊娠結(jié)局的隨訪，并于產(chǎn)后3～12個(gè)月對(duì)新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪，結(jié)果均與產(chǎn)前基因診斷結(jié)果相符。

目前，對(duì)地中海貧血雖無很好的根治辦法，但可防可控制，通過采取孕前檢查以及產(chǎn)前篩查和診斷等防控措施，可有效減少重型地貧患兒的出生。隨著優(yōu)生遺傳學(xué)的發(fā)展和輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步，可以選擇胚胎移植前診斷，選擇正?；虻呐咛ミM(jìn)行移植，避免中期妊娠診斷胎兒異常終止妊娠帶給孕婦的身心痛苦。在α-地貧高發(fā)地區(qū)開展非缺失型α-地貧的篩查與診斷尤為必要，可以為雙方均為α-地貧攜帶者的夫婦提供更加準(zhǔn)確的遺傳咨詢和優(yōu)生指導(dǎo)，是識(shí)別高危人群，預(yù)防重型地貧患兒出生的重要手段。

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Analysis on screening and prenatal diagnosis of non-deletion α-thalassemia in Guangzhou

QU Yanxia1，CHEN Guilan1，TANG Ying1，JIANG Fan1，ZUO Liandong1，GU Junmei2，LI Zhihua3
(1. Guangzhou women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510623; 2. Family Planning Service Station of Panyu District, Guangzhou 518000; 3. The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150，Guangdong, China)

R715.5

A

1004-616X(2016)02-0145-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.013

2015-08-17；

2015-10-26

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAI05A02，2012BAI09B01)；廣東省計(jì)劃生育委員會(huì)基金項(xiàng)目(2010208，20132031)；廣東省科技廳科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目(2010B060100014)

作者信息： 屈艷霞，E-mail：quyanxia2008@163.com