陳欣然，王　玲，王　薇，3，韓利霞，4，劉　莉，5，單保恩，，

4-硝基喹啉-1-氧化物誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的研究進(jìn)展

陳欣然1，王玲2，王薇1，3，韓利霞1，4，劉莉1，5，單保恩1，2，*

( 1. 河 北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北石家莊050035；2. 河 北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所免疫室，河北石家莊050035；3. 河北省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，河北石家莊050057；4. 河北省兒童醫(yī)院輸血科，河北石家莊050030；5. 白求恩國際和平醫(yī)院256臨床部檢驗(yàn)科，河北石家莊050080 )

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是一種常見且預(yù)后較差的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。建立ESCC模型，研究ESCC發(fā)病機(jī)制，對(duì)于降低ESCC的發(fā)病率和病死率具有重要意義。4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)是一種腫瘤誘導(dǎo)劑，已廣泛用于口腔癌的研究，而在ESCC研究中的應(yīng)用還較少。因此，本文就4NQO體內(nèi)代謝特點(diǎn)、誘導(dǎo)ESCC模型及誘癌機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期為食管癌的防治提供一些新的研究線索。

4-硝基喹啉-1-氧化物；食管鱗狀細(xì)胞癌；癌前病變；腫瘤誘導(dǎo)劑

目前，食管癌已成為嚴(yán)重影響人類生存及生活質(zhì)量的腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第8位和第6位[1]。中國是食管癌的高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率分別占全球食管癌發(fā)病率和死亡率的52.8%和49.3%[2]。食管癌的高發(fā)省份為河北、河南、福建和重慶，其次為新疆、江蘇、山西、甘肅和安徽。在河南林州，食管癌和賁門癌發(fā)病率最高，占當(dāng)?shù)厮袗盒阅[瘤的81.4%[3]。食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌[4]。中國的食管癌高發(fā)區(qū)95%以上為鱗狀細(xì)胞癌，因此建立ESCC模型，研究ESCC的自然進(jìn)程和發(fā)病機(jī)制，對(duì)于我國食管癌的預(yù)防和治療，降低食管癌的發(fā)病率和病死率，具有非常重要的意義。

ESCC的誘因很多，主要包括吸煙、飲酒、攝入過量含亞硝酸的食物或水，營養(yǎng)不均衡等。其中，亞硝酸物質(zhì)攝入過量已成為目前公認(rèn)的ESCC的主要誘發(fā)因素[2]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)是一種水溶性喹啉衍生物，能夠通過氧化應(yīng)激損傷和抑制DNA合成等機(jī)制誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)生[5]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，4NQO誘導(dǎo)腫瘤的形成具有一定的組織特異性，口服主要誘導(dǎo)口腔及上消化道系統(tǒng)腫瘤的形成，而皮下注射主要誘導(dǎo)肺癌的形成[6-9]。目前對(duì)于4NQO誘導(dǎo)口腔癌的研究報(bào)道較多，而對(duì)ESCC的報(bào)道較少。因此，本文主要就4NQO的理化性質(zhì)、體內(nèi)代謝特點(diǎn)、誘導(dǎo)ESCC模型及誘癌機(jī)制進(jìn)行簡要綜述。

1　4NQO體內(nèi)代謝特點(diǎn)及誘癌機(jī)制

4NQO為喹啉類衍生物，黃色粉末，易溶于水，為誘癌前體物，進(jìn)入體內(nèi)后，通過代謝成有活性的代謝產(chǎn)物發(fā)揮誘癌作用，其致癌作用起始于其硝基集團(tuán)被還原。4NQO被NADH：4NQO硝基還原酶還原成4-羥胺酸喹啉-1-氧化物(4-hydroxyaminoquinoline-1-oxide，4HAQO)和NADPH：苯醌還原酶[10]。帶有4個(gè)電子的產(chǎn)物4HAQO是DNA加成物。4HAQO可進(jìn)一步被乙?；x，并形成DNA加成物。4NQO的代謝產(chǎn)物在DNA的很多位點(diǎn)形成加成物，色譜分析表明有2個(gè)鳥嘌呤和1個(gè)腺嘌呤加成位點(diǎn)，但體內(nèi)研究表明4HAQO優(yōu)先與鳥嘌呤加成。4NQO乙?；x產(chǎn)物的3、4位可分別與鳥嘌呤的N2和C8位結(jié)合，與N2結(jié)合導(dǎo)致的突變較強(qiáng)而與C8結(jié)合導(dǎo)致的突變較弱，這種結(jié)合可導(dǎo)致鳥嘌呤被嘧啶代替[11]。4NQO還是UV類似物，可導(dǎo)致龐大的DNA加成物[12]。

4NQO活性代謝產(chǎn)物可通過氧化還原作用產(chǎn)生活性氧如超氧自由基和過氧自由基。氧化還原作用是在酶的催化下，喹啉化合物得到一個(gè)電子，繼而再將電子傳遞給一分子的氧，即產(chǎn)生超氧離子或過氧離子[13]?；钚匝跖c細(xì)胞內(nèi)具有氧化還原狀態(tài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)合，將其從還原態(tài)氧化成氧化態(tài)，從而激活轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生并誘導(dǎo)腫瘤形成。

4NQO誘導(dǎo)的基因毒性和細(xì)胞毒性可被多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein，MRP)和硫代轉(zhuǎn)移酶P1-1(gluthathione S-transferase P，GSTP1-1)逆轉(zhuǎn)[14]。4NQO是硫代轉(zhuǎn)移酶P(含GSTP1-1)的作用底物，其結(jié)合可被MRP帶出細(xì)胞。用放射活性的4NQO分析4NQO-DNA加成物的細(xì)胞毒性檢測表明MRP和GSTP1-1可對(duì)4NQO加成和細(xì)胞毒性產(chǎn)生高水平的保護(hù)作用。然而，MRP或GSTP1-1單獨(dú)作用對(duì)4NQO介導(dǎo)的細(xì)胞毒性保護(hù)作用很弱。這說明MRP和GSTP1-1在4NQO誘導(dǎo)腫瘤形成的起始和進(jìn)展過程中起重要的協(xié)同保護(hù)作用。

4NQO誘導(dǎo)腫瘤形成具有一定的組織特異性，口服攝入其腫瘤發(fā)生部位主要集中在舌的背面和腹面，腭部和食管[15-17]，而皮下注射還會(huì)影響到肺[18]。4NQO還原酶(硫辛酸氨脫氫酶)通過還原活化4NQO，對(duì)4NQO的敏感性起重要作用。食管部位存在大量的硫辛酸氨脫氫酶，因此與其他消化道相比，食管對(duì)4NQO的誘導(dǎo)作用更敏感。另外，4NQO還原酶的濃度與口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率呈正相關(guān)[19]。這些結(jié)果表明高4NQO還原酶活性可增加4NQO誘癌的易感性[14]。

4NQO在誘導(dǎo)腫瘤形成模型中具有一定的種屬特異性。4NQO對(duì)不同大鼠種系[Dark A gouti ( DA)、Long E vans、S prague D waley (SD)、ACI/MS Fisher 344、Donryu和Wistar/Furth (WF)]作用不同， WF大鼠耐受性較強(qiáng)而DA對(duì)4NQO誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌最敏感[20]。DA和WF雜交大鼠是DA大鼠敏感性的5倍[21]。因此，用4NQO作為致癌誘導(dǎo)劑，其保護(hù)或敏感區(qū)域基因均可被鑒定。推測這些敏感及耐受基因及其與鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系對(duì)于探索惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制具有重要的作用。

2　4NQO體外細(xì)胞毒性研究

目前尚無4NQO對(duì)食管鱗狀細(xì)胞的作用研究。Darroudi等[22]發(fā)現(xiàn)4NQO可造成中國倉鼠紫外線敏感損傷修復(fù)缺陷的CHO細(xì)胞和43-3B細(xì)胞死亡、染色體異常和姐妹染色單體置換。Bosselaers等[23]報(bào)道4NQO可造成中國倉鼠肺V79細(xì)胞姐妹染色單體異常。在4NQO對(duì)頭頸部細(xì)胞的作用研究中，Kim等[24]用mtDNA(線粒體DNA)/nDNA(核DNA)比率反映線粒體損傷修復(fù)能力，結(jié)果表明，與4NQO未處理組相比，4NQO作用24 h的JHUO19 (舌癌細(xì)胞)和JHU-O22(扁桃體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞)細(xì)胞mtDNA/nDNA比率分別降低37%和40%，而用于對(duì)照的角化細(xì)胞系mtDNA/nDNA比率卻有所增加。由以上結(jié)果可知，4NQO具有一定的細(xì)胞毒性，能夠造成細(xì)胞死亡、染色體損傷和染色體損傷修復(fù)能力的降低，而4NQO對(duì)于食管鱗狀細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步的研究。

3　4NQO體內(nèi)誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的研究

如表1所示，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，4NQO可成功誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的形成。目前用于體內(nèi)研究的動(dòng)物主要為小鼠，其中常用的是C57BL/6小鼠，其次為CBA，ICR和L2-D1小鼠。雖然飲水法和涂抹法均可誘導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌的形成，但涂抹法僅用于口腔鱗癌的誘導(dǎo)，而飲水法更適用于食管鱗狀細(xì)胞癌的研究。一般來說，用于誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的4NQO濃度為50或100 μg/mL，誘癌時(shí)間為16～20周，觀察時(shí)間為28周。誘癌過程中，通過HE染色，可清楚觀察到小鼠食管經(jīng)歷正常、上皮增生、原位癌和浸潤性癌4個(gè)病理過程，病變程度與4NQO濃度和誘癌時(shí)間均呈顯著正相關(guān)。而且，小鼠食管癌形成的病變特點(diǎn)與人食管癌病變形成過程非常相似。綜上可知，4NQO飲水法是體內(nèi)誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌的良好模型。

表1　4NQO體內(nèi)誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌實(shí)驗(yàn)的總結(jié)

4　4NQO誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌模型的評(píng)價(jià)

目前用于食管癌的模型主要有自發(fā)性動(dòng)物模型、移植性動(dòng)物模型、誘發(fā)性動(dòng)物模型和基因工程模型。4NQO誘發(fā)的食管鱗狀細(xì)胞癌模型較其他類型的模型具有一定的優(yōu)越性[31]。

自發(fā)性動(dòng)物模型指在自然情況下所發(fā)生的食管癌動(dòng)物模型。該模型完全在自然條件下發(fā)生，食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程與人類食管癌相似，主要是反映動(dòng)物的腫瘤易感性、環(huán)境致癌物質(zhì)和促癌物質(zhì)的積聚程度。雖然這種模型在理論上較理想，但其存在較大局限性，如發(fā)生率低且不穩(wěn)定，發(fā)生時(shí)間較難預(yù)測且參差不齊，荷瘤動(dòng)物個(gè)體在品系、性別、年齡、腫瘤發(fā)生時(shí)間、大小等均有較大差異。異種移植模型可以對(duì)食管癌組織或者細(xì)胞株進(jìn)行倍增時(shí)間、侵襲轉(zhuǎn)移能力等多種表型特性的鑒定，同時(shí)對(duì)基因、信號(hào)通路等相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，最主要的應(yīng)用是進(jìn)行相關(guān)抗腫瘤藥物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。然而，移植瘤模型只是對(duì)瘤性組織或具有成瘤性的細(xì)胞株的生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)估，而無法模擬腫瘤成瘤前的一系列基因突變的累計(jì)過程，且不能評(píng)估免疫系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)展中的作用，所以，該模型還遠(yuǎn)不能滿足闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制的要求。誘發(fā)性食管癌動(dòng)物模型為致癌因素與受體動(dòng)物食管部位直接或間接接觸，使食管部位產(chǎn)生腫瘤的模型。誘發(fā)性食管動(dòng)物模型操作方法簡單，靶器官和誘癌劑恒定，誘發(fā)成瘤率高，基本模擬了食管癌變的發(fā)生過程，接近人類食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，使人們得以有計(jì)劃、有步驟地觀察食管癌變的整個(gè)過程，是進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床食管癌研究的常用方法。目前用于誘發(fā)性食管癌的誘癌劑主要有甲基芐基亞硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine，NMDA)、甲基戊基亞硝胺(methyl-n-amyl nitrosamine/N-Amyl-N-dimethylnitrosamine，MNAN/AMN)和4NQO。然而，NMDA和MNAN/AMN主要用于大鼠食管癌誘導(dǎo)模型，而4NQO可成功誘導(dǎo)小鼠ESCC?；蚬こ棠Ｐ涂梢酝ㄟ^基因敲入/敲出技術(shù)構(gòu)建基因工程動(dòng)物，進(jìn)一步明確特定分子事件在食管癌發(fā)生發(fā)展各階段的空間時(shí)序，從而找到關(guān)鍵靶標(biāo)，設(shè)計(jì)相應(yīng)靶向治療藥物或者相應(yīng)的治療策略。然而，目前用于誘導(dǎo)ESCC的基因工程模型主要局限于CyclinD1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠和P53基因突變小鼠，而且兩種基因工程小鼠不能直接發(fā)生ESCC。

結(jié)合以上食管癌模型的特點(diǎn)可以推斷誘發(fā)性食管癌模型和基因工程模型相結(jié)合是誘導(dǎo)ESCC的較好組合。利用基因工程小鼠導(dǎo)入或敲除特定基因后，通過4NQO飲水法誘導(dǎo)小鼠食管鱗狀上皮細(xì)胞癌及癌前病變，研究靶基因在食管癌形成中的表達(dá)變化及在食管癌形成中的作用，既可以較好模擬ESCC的發(fā)生過程，又可研究特定基因在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，是研究ESCC發(fā)病機(jī)制及尋找ESCC腫瘤標(biāo)志物較為理想的模型。

5　 展 望

4NQO作為誘癌劑能夠成功誘導(dǎo)ESCC，對(duì)于研究ESCC的發(fā)生機(jī)制、尋找ESCC及癌前病變的生物標(biāo)志物，探索ESCC新的治療策略具有重要意義。然而，在4NQO誘導(dǎo)的ESCC研究中，腫瘤標(biāo)志物的研究還較少，因此，應(yīng)該利用基因工程小鼠聯(lián)合4NQO誘導(dǎo)模型，加強(qiáng)腫瘤標(biāo)志物的研究，對(duì)食管癌及癌前病變的預(yù)防和診斷具有重要意義。另外，應(yīng)加強(qiáng)體外4NQO對(duì)食管鱗狀細(xì)胞或其相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的作用研究，結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入探討ESCC的發(fā)病機(jī)制，為ESCC的治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

[1] Herszényi L，Tulassay Z. Epidemiology of gastrointestinal and liver tumors[J]. Eur Rev Med Pharmacol S ci，2010，14(4)：249-258.

[2] 吳巖，賀宇彤. 食管癌病因?qū)W[J]. 食管外科電子雜志，2014，2(3)：114-120.

[3] 赫捷，邵康. 中國食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀，診療現(xiàn)狀及未來對(duì)策[J]. 中 國癌癥雜志，2011，21(7)：501-504.

[4] Henry MA，Lerco MM，Ribeiro PW，et al. Epidemiological features of esophageal cancer：Squamous cell carcinoma versus adenocarcinoma[J]. Acta Cir Bras，2014，29(6)：389-393.

[5] Kanojia D，Vaidya MM. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis[J]. Oral Oncol，2006，42(7)：655-667.

[6] Imaida K，Sato H，Okamiya H，et al. Enhancing effect of high fat diet on 4-nitroquinoline 1-oxide-induced pulmonary tumorigenesis in ICR male mice[J]. Jpn J Cancer Res，1989，80(6)：499-502.

[7] Shrotriya S，Tyagi A，Deep G，et al. Grape seed extract and resveratrol prevent 4-nitroquinoline 1-oxide induced oral tumorigenesis in mice by modulating AMPK activation and associated biological responses[J]. M ol Carcinog， 2015，54(4)：291-300.

[8] Chen Y，Jiang Y，Liao L，et al. Inhibition of 4NQO-induced oral carcinogenesis by dietary oyster shell calcium[J]. Integr Cancer Ther，2015. doi：10.1177/1534735415596572.

[9] Jiang Y，Liao L，Shrestha C，et al. Inhibition of 4-nitroquinoline-1-oxide-induced oral carcinogenesis by dietary calcium[J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8(4)：3529-3542.

[10] Enson AM. Conversion of 4-nitroquinoline-1-oxide(4NQO) to 4-hydroxyamino- quinoline-1-oxide by a dicumarol-resistant hepatic 4NQO introreductase in rats and mice[J]. Biochem Pharmacol，1993，46(7)：1217-1221.

[11] Brüsehafer K，Manshian BB，Doherty AT，et al. The clastogenicity of 4NQO is cell-type dependent and linked to cytotoxicity，length of exposure and p53 proficiency[J]. Mutagenesis，2015. doi：10.1093/ mutage/gev069.

[12] Waters R，Jones CJ，Martin EA，et al. The repair of large DNA adducts in mammalian cells[J]. Mutat Res，1992，273(2)：145-155.

[13] Urvalek AM，Osei-Sarfo K，Tang XH，et al. Identification of ethanol and 4-nitroquinoline-1-oxide induced epigenetic and oxidative stress markers during oral cavity carcinogenesis[J]. Alcohol Clin Exp Res，2015，39(8)：1360-1372.

[14] Morrow CS，Diah S，Smitherman PK，et al. Multidrug resistance protein and glutathione S-transferase P1-1 act in synergy to confer protection from 4-nitroquinoline-1-oxide toxicity[J]. Carcinogenesis，1998，19(1)：109-115.

[15] de Visscher SA，Witjes MJ，vander Vegt B，et al. Localization of liposomal mTHPC formulations within normal epithelium，dysplastic tissue，and carcinoma of oral epithelium in the 4NQO-carcinogenesis rat model[J]. Lasers Surg Med， 2013，45(10)：668-678.

[16] Chu M，Su YX，Wang L，et al. Myeloid-derived suppressor cells contribute to oral cancer progression in 4NQO-treated mice[J]. Oral Dis， 2012，18(1)：67-73.

[17] Yang Z，Guan B，Men T，et al. Comparable molecular alterations in 4-nitroquinoline 1-oxide-induced oral and esophageal cancer in mice and in human esophageal cancer，associated with poor prognosis of patients[J]. In Vivo， 2013，27(4)：473-484.

[18] Nunoshiba T，Demple B. Potent intracellular oxidative stress exerted by the carcinogen 4-nitroquinoline-N-oxide[J]. Cancer Res，1993，53(14)：3250-3252.

[19] Booth DR. A relationship found between intra-oral sites of 4NQO reductase activity and chemical carcinogenesis[J]. Cell Tissue Kinet，1990，23(4)：331-340.

[20] Kitano M，Hatano H，Shisa H. Strain difference of susceptibility to 4-nitroquinoline-1-oxide-induced togue carcinoma in rats[J]. Jpn J Cancer Res，1992，83(8)：843-850.

[21] Tanuma JI，F(xiàn)ujii K，Hiirano M，et al. Five quantitative traint loci affecting 4-nitroquinoline-1-oxide indeced tongue cancer in the rat[J]. Jpn J Cancer Res，2001，92(6)：610-616.

[22] Darroudi F，Natarajan AT，Lohman PH. Cytogenetical characterization of UV-sensitive repair-deficient CHO cell line 43-3B II induction of cell killing，chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges by 4NQO，mono- and bi-functional alkylating agents[J]. Mutat Res，1989，212(2)：103-112.

[23] Bosselaers IE，Caessens PW，Van Boekel MA，et al. Differential effects of milk proteins，BSA and soy protein on 4NQO- or MNNG-induced SCEs in V79 cells[J]. Food Chem Toxicol，1994，32(10)：905-909.

[24] Kim MM，Glazer CA，Mambo E，et al. Head and neck cancer cell lines exhibit differential mitochondrial repair deficiency in response to 4NQO[J]. Oral Oncol，2006，42(2)：201-207.

[25] 陳慧，高鑫，李剛，等. 4NQO誘發(fā)C57BL/6小鼠舌癌及食管鱗狀細(xì)胞癌模型的建立[J]. 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，30(5)：972-974.

[26] 李晶，于大海，卿海云，等. 4-硝基喹啉-1-氧化物飲水法構(gòu)建BALB/C小鼠胃癌及食管癌模型[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28(9)：1411.

[27] 杜展，王超，張勇，等. C57BL/6小鼠食管鱗狀細(xì)胞癌早期病變的形態(tài)學(xué)改變[J]. 世 界華人消化雜志，2013，21(2)：116-121.

[28] Tang XH，Knudsen B，Bemis D，et al. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice[J]. Clin Cancer Res，2004，10(1)：301-303.

[29] Gunji A，Uemura A，Tsutsumi M，et al. Parp-1 deficiency does not increase the frequency of tumors in the oral cavity and esophagus of ICR/129Sv mice by 4-nitroquinoline 1-oxide，a carcinogen producing bulky adducts[J]. Cancer Lett，2006，241(1)：87-92.

[30] Wilkey JF，Buchberger G，Saucier K，et al. Cyclin D1 overexpression increases susceptibility to 4-nitroquinoline-1-oxide-induced dysplasia and neoplasia in murine squamous oral epithelium[J]. Mol Carcinog，2009，48(9)：853-861.

[31] 黃裔騰，殷秀凱，鐘雪云，等. 食管鱗癌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2011，19(16)：1704-1710.

R735.1

A

1004-616X(2016)02-0151-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.015

2015-07-01；

2015-12-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173611)；河北省重點(diǎn)醫(yī)學(xué)科研課題(zd2013045)；河北省教育廳學(xué)位辦高等學(xué)校研究生創(chuàng)新資助項(xiàng)目

作者信息： 陳欣然，E-mail：cxrtht@163.com。*

，單保恩，E-mail：shanbaoen_1962@163.com