王　珊，柏　青，王方萍，李慧瑤，陳　燊，何志妮，王　慶，陳　雯，陳麗萍

原代小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較

王珊，柏青，王方萍，李慧瑤，陳燊，何志妮，王慶，陳雯，陳麗萍*

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東廣州510080）

目的： 比較3種不同培養(yǎng)條件下原代小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)以及肝細(xì)胞功能，尋找適合于原代小鼠肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方。方法：采用改良Seglen兩步膠原酶灌注法分離原代小鼠肝細(xì)胞，糖原染色觀察細(xì)胞純度，在貼壁4 h后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基加DMSO(DMSO組)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基加DMSO和EGF(DMSO+EGF組)等3種不同的條件培養(yǎng)肝細(xì)胞。鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)水平以及用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白蛋白水平。結(jié)果：成功分離小鼠原代肝細(xì)胞，肝細(xì)胞純度達(dá)95%以上；原代肝細(xì)胞培養(yǎng)至96 h時(shí)，DMSO組仍能較好地維持細(xì)胞形態(tài)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的細(xì)胞活力比DMSO組和DMSO+EGF組分別降低了66.87%和67.16%(P＜0.05)，且基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的LDH水平均高于DMSO組和DMSO+EGF組(P＜0.05)。此外DMSO組在96 h時(shí)仍能維持較高水平的白蛋白分泌，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基組和DMSO+EGF組分別增加了185%和24.2%(P＜0.05)。結(jié)論：小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO對(duì)于維持肝細(xì)胞的形態(tài)和功能有促進(jìn)作用，本研究為體外原代肝細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立和優(yōu)化提供了實(shí)用的方法。

小鼠；原代肝細(xì)胞培養(yǎng)；二甲基亞砜；表皮生長(zhǎng)因子

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To identify a better maintenance medium for primary hepatocyte culture in vitro，wecompare the cellular morphology and function of mouse primary hepatocytes under three different culture conditions.METHODS：Primary hepatocytes were isolated by using a modified two-step collagenase perfusion procedure asdescribed by Seglen. The purity of hepatocytes were determined by PAS staining. After plating for 4 h，the medium wasreplaced with three different maintenance medium (base medium，base medium supplemented with DMSO，base mediumsupplemented with DMSO and EGF). The cellular morphology was observed under an inverted microscope. The cellviability was measured using the MTT assay，the concentrations of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by automaticbiochemical analyzer and the albumin level was examined using ELISA. RESULTS：Mouse primary hepatocytes weresuccessfully isolated with purity more than 95%. When primary hepatocytes were cultured for 96 h ，only the DMSO grouphad better cell morphology. Viability of cells in the base medium group was reduced by 66.87% and 67.16% compared withthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05)，respectively. The LDH level of the base medium group was higher thanthe DMSO and the DMSO+EGF groups (P＜0.05). In addition，cells in the DMSO group had high level of albumin secretionat 96h which was 185% and 24.2% higher than the base medium and the DMSO+EGF group (P＜0.05)，respectively.CONCLUSION：DMSO addition to maintenance medium supported primary hepatocytes to maintain its morphology andfunction. Our study provides an applicable method for optimization of primary hepatocytes in culture.

【KEY WORDS】mouse；primary hepatocyte culture；dimethyl sulfoxide；epidermal g rowth f actor

原代肝細(xì)胞作為一種肝毒性評(píng)價(jià)體外模型，既能較好地保留肝臟的代謝功能，還可反映外源化學(xué)物的刺激，并能排除其他細(xì)胞、組織的影響，具有良好的可重復(fù)性，被認(rèn)為是目前體外毒理學(xué)和藥物試驗(yàn)的重要研究模型而得到廣泛應(yīng)用[1]。然而，原代肝細(xì)胞分離后在體外培養(yǎng)過(guò)程中很快喪失其正常表型及功能，并迅速進(jìn)入失分化和衰老狀態(tài)。因此，體外原代肝細(xì)胞存活時(shí)間短、失去正常肝細(xì)胞功能，以及不同實(shí)驗(yàn)室由于技術(shù)上掌握的熟練程度不同帶來(lái)的毒性評(píng)價(jià)偏倚，大大降低了肝細(xì)胞模型在化學(xué)物毒性測(cè)試中的應(yīng)用價(jià)值。一直以來(lái)，研究者們探索不同方法來(lái)改善原代肝細(xì)胞的微環(huán)境，進(jìn)而維持肝細(xì)胞的功能，其主要通過(guò)添加促分化因子、細(xì)胞外基質(zhì)或與其他細(xì)胞共培養(yǎng)。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)是兩種能促進(jìn)肝細(xì)胞分化的因子[2-4]，本研究通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加DMSO或EGF，以不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞損傷和白蛋白分泌功能等指標(biāo)來(lái)評(píng)估在不同培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞的形態(tài)和功能，尋找最佳的培養(yǎng)條件，延長(zhǎng)原代肝細(xì)胞的體外分離后的正常功能維持時(shí)間，促進(jìn)其在毒理學(xué)或藥理學(xué)中的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，25～30 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK (粵)2011-0029。

1.2主要試劑和儀器

William’s E培養(yǎng)基、IV型膠原酶、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES]、青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自法國(guó)Biowest公司；地塞米松、牛胰島素、表皮生長(zhǎng)因子均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Percol密度分離液購(gòu)自美國(guó)BD公司；DMSO 購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；白蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Cell Titer 96?AQueous One Solution 細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

主要儀器包括：倒置顯微鏡(Nikon，Japan)、酶標(biāo)儀(Biorad，USA)、全自動(dòng)生化分析儀(7600-020 HITACH，Japan)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分離小鼠原代肝細(xì)胞在Seglen兩步膠原酶灌注法[5]基礎(chǔ)上改進(jìn)分離小鼠原代肝細(xì)胞方法。C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(0.5 mg/g)麻醉，常規(guī)消毒皮膚，開(kāi)腹，肝門靜脈插管固定，用含EGTA的D-Hanks灌流液灌流。然后灌流含1.6 mmol/L CaCl2和0.5 mg/mL IV型膠原酶的D-Hanks液約40 mL至肝臟變軟，剪下肝臟，劃破肝包膜，收集細(xì)胞懸液，并用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，4 ℃、50 g離心，然后用含有2 mmol/L CaCl2的DHanks清洗液清洗3次，再用清洗液重懸并加入預(yù)先配置好的Percol密度分離液中，100 g離心20 min。最后用含F(xiàn)BS的William’s E培養(yǎng)基重懸，0.4%臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞存活率需大于90%。

1.3.2小鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法小鼠原代肝細(xì)胞以1.0×105/cm2的細(xì)胞密度接種于包被有鼠尾膠原的培養(yǎng)板內(nèi)。使用貼壁培養(yǎng)基(William’s E培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、4 μg/mL牛胰島素、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、15 mmol/L HEPES)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，將培養(yǎng)基吸出，鋪上層膠原，形成三明治結(jié)構(gòu)。2 h后分為3組分別加入不同的無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)維持肝細(xì)胞生長(zhǎng)。第1種維持培養(yǎng)基綜合了文獻(xiàn)中常用的培養(yǎng)基成分(William’s E培養(yǎng)基、0.1 μmol/L地塞米松、4 μg/mL牛胰島素、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、15 mmol/L HEPES)(下稱基礎(chǔ)培養(yǎng)基組)；第2種培養(yǎng)基在第1種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了2% DMSO(下稱DMSO組)；第3種培養(yǎng)基在第1種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上同時(shí)添加了2% DMSO和12.5 ng/mL EGF(下稱DMSO+EGF組)。每天更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.3糖原染色法鑒定肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，PBS清洗2～3次，多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗2～3次，加入高碘酸溶液反應(yīng)10 min，蒸餾水洗2～3次，每次1 min，接著用Shiff液染色30 min，蒸餾水洗2～3次，繼以蘇木素染色液染細(xì)胞核1～2 min，酸性乙醇分化液分化2～5 s，用自來(lái)水沖洗2～3次，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4MTT法檢測(cè)小鼠原代肝細(xì)胞的細(xì)胞活力小鼠原代肝細(xì)胞以每孔3×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板，每孔設(shè)置3個(gè)平行樣，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。利用Cell Titer 96?AQueous One Solution 細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)肝細(xì)胞的細(xì)胞活力。每孔加入Cell Titer 96?AQueous One Solution 試劑20 μL，37 ℃孵育4 h，選擇490 nm波長(zhǎng)，用空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度D(490)值。

1.3.5培養(yǎng)細(xì)胞上清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)水平檢測(cè)小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h 時(shí)分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，12 0 00 r/min離心10 m in，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH的水平。1.3.6 培養(yǎng)細(xì)胞上清中白蛋白水平的檢測(cè)在小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)分別收集培養(yǎng)基上清。采用ELISA法白蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清中的白蛋白水平。450和570 nm雙波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，調(diào)零后用四參數(shù)邏輯回歸分析(4-parameter logistic regression)計(jì)算白蛋白水平。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

各組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用x±s表示，用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)的比較用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)條件對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞形態(tài)的影響

小鼠原代肝細(xì)胞分離成功并培養(yǎng)4 h后，用PAS染色法在倒置顯微鏡下觀察貼壁小鼠原代肝細(xì)胞。鏡下發(fā)現(xiàn)，小鼠原代肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)均可見(jiàn)紫紅色糖原顆粒，大部分肝細(xì)胞均已貼壁并伸展成圓形或多邊形，純度超過(guò)95%(圖1)。原代肝細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48和96 h后鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)。如圖2所示，培養(yǎng)24 h時(shí)，3種培養(yǎng)條件下的肝細(xì)胞均表現(xiàn)為多邊形，少數(shù)呈圓形。大多數(shù)肝細(xì)胞中可見(jiàn)雙核，細(xì)胞間相互接觸，界限清晰，排列成肝索樣結(jié)構(gòu)，呈典型的肝細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)48 h后，肝細(xì)胞由立體逐漸變成扁平的多邊形結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)至96 h，基礎(chǔ)培養(yǎng)組的細(xì)胞間的邊界模糊，細(xì)胞核增大，細(xì)胞形態(tài)不能辨認(rèn)，DMSO+EGF組的細(xì)胞間的邊界變模糊，逐漸喪失多邊形結(jié)構(gòu)，只有添加了2% DMSO組的肝細(xì)胞還能維持較好的肝細(xì)胞的多邊形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間的邊界仍較清晰。上述實(shí)驗(yàn)表明在原代肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基中添加2% DMSO可以更好維持肝細(xì)胞的形態(tài)。

圖1　PAS染色觀察小鼠原代肝細(xì)胞貼壁4 h后的形態(tài)(×400)

圖2　不同培養(yǎng)條件下各時(shí)間點(diǎn)原代小鼠肝細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.2不同培養(yǎng)條件對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞活力的影響

我們進(jìn)一步采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖3所示，3種不同培養(yǎng)條件下小鼠原代肝細(xì)胞的細(xì)胞活力的D(490)值在48 h達(dá)到峰值，提示細(xì)胞活力處于最佳狀態(tài)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，3種條件下肝細(xì)胞的細(xì)胞活力開(kāi)始逐漸下降，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基組下降最為顯著。在96 h時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的D(490)值比DMSO組和DMSO +EGF組降低了66.87%和67.16%，而DMSO組和DMSO+EGF組無(wú)明顯區(qū)別，提示在培養(yǎng)基中添加了DMSO或EGF可以提高原代肝細(xì)胞的細(xì)胞活力。

圖3　不同培養(yǎng)條件下小鼠原代肝細(xì)胞的細(xì)胞活力

2.3不同培養(yǎng)條件對(duì)肝細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH的影響

細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH水平可以作為肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志。如圖4所示，3種培養(yǎng)方式肝細(xì)胞培養(yǎng)上清的LDH水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸下降。但在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的LDH水平均高于DMSO組和DMSO+EGF組。表明培養(yǎng)基中添加DMSO或EGF可以減少肝細(xì)胞的損傷。

圖4　不同培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平

2.4不同培養(yǎng)條件對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞白蛋白分泌的影響

白蛋白分泌能力是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能的重要指標(biāo)，因此我們檢測(cè)3種培養(yǎng)條件下小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基中的白蛋白水平。如圖5所示，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的白蛋白分泌在48 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，而DMSO+ EGF組的白蛋白水平在72 h時(shí)達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下降。DMSO組的白蛋白分泌在肝細(xì)胞分離后逐漸升高，在72 h時(shí)達(dá)到峰值，并在96 h時(shí)仍能維持白蛋白的高水平，且比基礎(chǔ)培養(yǎng)基組和DMSO+EGF組分別增加了185%倍和24.2%，提示培養(yǎng)基中單獨(dú)添加DMSO可以更好地維持白蛋白的分泌。綜合上述結(jié)果顯示培養(yǎng)基中添加DMSO可更好地維持肝細(xì)胞的形態(tài)、活力和功能。雖然同時(shí)添加DMSO和EGF能促進(jìn)細(xì)胞存活，但在細(xì)胞形態(tài)和功能維持上與單獨(dú)添加DMSO相比沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。綜合細(xì)胞形態(tài)、活力、LDH和白蛋白分泌4個(gè)指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加DMSO的效果最佳。

圖5　不同培養(yǎng)條件下小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的白蛋白水平

3　討論

肝臟是外源化學(xué)物代謝的重要器官，通過(guò)肝臟的代謝作用，許多外源化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒、低毒或毒性更大的代謝產(chǎn)物，因此肝臟是毒理學(xué)和藥理學(xué)研究的重要靶器官。目前已有很多體外肝臟模型用于毒物的代謝、代謝機(jī)制及毒物間相互作用的研究，如肝組織切片、肝臟灌流、原代肝細(xì)胞、肝微粒體和永生化肝細(xì)胞系等[1]。其中，原代肝細(xì)胞被認(rèn)為是體外試驗(yàn)的一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的模型，它能夠維持肝細(xì)胞的功能達(dá)24～72 h，可用于酶的誘導(dǎo)和抑制試驗(yàn)，中等通量的外源化學(xué)物毒性篩查以及比較物種內(nèi)和物種間的代謝差異[6-7]。然而，原代肝細(xì)胞在體外分離后迅速啟動(dòng)失分化機(jī)制，主要原因是在分離的過(guò)程中失去了正常肝細(xì)胞的微環(huán)境、細(xì)胞間相互作用以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[8-10]，限制了其在化學(xué)物毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。因此，探索長(zhǎng)時(shí)間有效維持肝細(xì)胞功能的培養(yǎng)條件是目前亟需解決的問(wèn)題。本研究使用不同的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、細(xì)胞損傷和白蛋白分泌這4個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)其培養(yǎng)效果。我們發(fā)現(xiàn)添加2% DMSO的維持培養(yǎng)基能使肝細(xì)胞維持良好的形態(tài)和細(xì)胞活力，減輕肝細(xì)胞損傷，且維持白蛋白分泌的時(shí)間更長(zhǎng)、分泌能力更強(qiáng)。我們的研究結(jié)果為完善體外原代肝細(xì)胞在藥理學(xué)和毒理學(xué)中的應(yīng)用提供了較實(shí)用的方法。

本研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了DMSO可以更好維持原代肝細(xì)胞的形態(tài)和功能。以往Isom等[11]研究也發(fā)現(xiàn)大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基中添加DMSO可促進(jìn)肝細(xì)胞分化。然而，我們基于其研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的方法。相比之下，本研究獲得純化的原代肝細(xì)胞，且使用三明治結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)方法以更好地維持細(xì)胞形態(tài)[12]，并嘗試在DMSO的基礎(chǔ)上添加EGF，以篩查更好的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)條件。此外，本研究旨在優(yōu)化原代肝細(xì)胞模型以用于毒理學(xué)或藥理學(xué)評(píng)價(jià)，毒理學(xué)和藥理學(xué)評(píng)價(jià)主要依賴肝細(xì)胞的代謝作用，而原代肝細(xì)胞的代謝酶在分離出體外后24～72 h則會(huì)迅速下降，因此本研究選用96 h為最長(zhǎng)觀察時(shí)間。DMSO是一種氧自由基清除劑，既往研究發(fā)現(xiàn)它能較好地維持肝細(xì)胞的形態(tài)，CYP酶系和肝特異轉(zhuǎn)錄因子(如HNF-3，HNF-4和C/EBP)的表達(dá)，改進(jìn)白蛋白分泌的功能[13-14]。然而其作用機(jī)制尚不明確，有研究認(rèn)為這些功能可能與其抑制肝細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停留在細(xì)胞G1期相關(guān)[15]，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。此外，我們也發(fā)現(xiàn)添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)能促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的存活，但并不能長(zhǎng)時(shí)間維持肝細(xì)胞形態(tài)和白蛋白分泌功能，即使添加DMSO也不能恢復(fù)，相關(guān)機(jī)制不清楚。EGF是能促進(jìn)有絲分裂的激素，在促進(jìn)原代細(xì)胞增殖和存活中起作用，然而研究發(fā)現(xiàn)EGF能激活磷脂酶A2，引起原代肝細(xì)胞扁平化，導(dǎo)致CYP酶表達(dá)降低[16-17]。因此EGF作為原代肝細(xì)胞培養(yǎng)的添加因子還需結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康募罢{(diào)整添加劑量，而DMSO作為原代細(xì)胞培養(yǎng)基的一個(gè)添加成分，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，且容易獲得，是一個(gè)較好的培養(yǎng)基的添加成分。

目前國(guó)外關(guān)于原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)更多地關(guān)注于將多種抗失分化的手段結(jié)合在一起模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境[18-20]，以更好地維持肝細(xì)胞的形態(tài)和功能。例如將微流體系統(tǒng)、3D培養(yǎng)、與其他非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、庫(kù)否細(xì)胞)共培養(yǎng)，以及添加促分化的細(xì)胞培養(yǎng)基共同結(jié)合在一起，可以使肝細(xì)胞的白蛋白和尿素分泌在14 d保持較高水平，用CYP450代謝酶的誘導(dǎo)劑能誘導(dǎo)出較高的代謝酶活性[21]。而本研究主要關(guān)注于對(duì)促分化培養(yǎng)基成分的改進(jìn)，旨在為原代肝細(xì)胞模型的構(gòu)建和優(yōu)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在維持培養(yǎng)基中添加DMSO有利于保留其與小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞相近的形態(tài)與功能，為體外肝細(xì)胞模型局限性提供了新的方法。未來(lái)體外代謝模型構(gòu)建的發(fā)展方向主要是模擬人源細(xì)胞的代謝模式，雖然人源原代肝細(xì)胞模型能最大程度的模擬人體細(xì)胞對(duì)外源化學(xué)物刺激的反應(yīng)，在體外毒性檢測(cè)中最具應(yīng)用價(jià)值，但是由于可及性差以及個(gè)體差異性而無(wú)法全面推廣?；谏锕こ痰姆抡娲x模型的構(gòu)建將是重要的發(fā)展趨勢(shì)。

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Comparison of different culture methods for mouse primary hepatocyte

WANG Shan，BAI Qing，WANG Fangping，LI Huiyao，CHEN Shen，HE Zhini，WANG Qing，CHEN Wen，CHEN Liping*
(Faculty of Preventive Medicine, School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)

R114

A

1004-616X(2016)02-0125-06

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.009

2016-02-12；

2016-02-27

廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(S2013020012725)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31401213)

作者信息： 王珊，E-mail：274639734@qq.com。*

，陳麗萍，E-mail：chenliping_happy06@163.com