■陳志穎　江建梅　徐婷婷　舒　媛　陳冠青　吳　振　張子健

（唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山063000）

啤酒酵母細胞壁中甘露聚糖檢測方法研究

■陳志穎江建梅徐婷婷舒媛陳冠青吳振張子健

（唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山063000）

建立了啤酒酵母細胞壁中甘露聚糖含量的測定方法。用堿溶液進行前處理后，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定甘露聚糖含量。試驗結(jié)果表明，樣品的前處理條件為NaOH濃度0.6%、浸提溫度75℃、浸提時間30 min；檢測條件為波長490 nm、反應(yīng)溫度100℃、反應(yīng)時間20 min，在20.00～90.00 μg/ml范圍內(nèi)吸光度與被測物含量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，平均回收率100.78%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.23%。由此可見，該方法簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、結(jié)果可靠，可用于測定啤酒酵母細胞壁中甘露聚糖含量。

啤酒酵母；細胞壁；甘露聚糖；苯酚-硫酸法

2013年我國啤酒產(chǎn)量達到了5 062萬噸，穩(wěn)居世界第一，已成為啤酒生產(chǎn)和消費大國，同時也產(chǎn)生了300～400萬噸副產(chǎn)物啤酒酵母，而這些啤酒酵母泥中含有48%～55%的蛋白質(zhì)，23%～28%的碳水化合物，6%～8%的核酸，2%的維生素B族，1%的谷胱甘肽以及豐富的氨基酸和多種礦物質(zhì)［1］，這些營養(yǎng)成分并沒有得到充分的利用，因此對啤酒酵母泥進行回收利用具有明顯的社會效益和經(jīng)濟效益。

啤酒酵母細胞壁是以啤酒酵母為原料采用定向酶解與高效破壁技術(shù)精制生產(chǎn)制得，具有促進機體生長，提高免疫功能等作用。甘露聚糖位于酵母細胞壁的最外層，占細胞壁干重的40%左右，與處于中、內(nèi)層的葡聚糖一起構(gòu)成酵母細胞壁的主要多糖成分［2］。由于其具有免疫調(diào)節(jié)［3］、改善腸道健康［4］、選擇性吸附病原微生物、吸附霉菌毒素［5］等功能，甘露聚糖是免疫功能最強的酵母細胞壁多糖［6］，因此甘露聚糖含量是衡量酵母細胞壁質(zhì)量的一個關(guān)鍵性指標(biāo)。但目前關(guān)于啤酒酵母細胞壁甘露聚糖檢測方法報道很少，目前飼料行業(yè)單一飼料中單細胞蛋白需要檢測釀酒酵母細胞壁和釀酒酵母水解物中的甘露聚糖含量，但目前缺乏國家和行業(yè)相應(yīng)的檢測方法。因此本研究旨在提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確度高的甘露聚糖的測定方法，對酵母源生物飼料產(chǎn)品應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料

樣品為唐山拓普生物科技有限公司生產(chǎn)的啤酒酵母細胞壁粉。

1.2試劑

濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉，以上試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；

甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer）。

1.3主要儀器

VIS-723N紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；DFD-700電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。

1.4方法

1.4.1甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取經(jīng)（103±2）℃干燥至恒重的0.020 0 g甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶于水，定容至200 ml，得到濃度為100 μg/ml的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.25%苯酚溶液的配制

精密稱取重蒸餾苯酚15.0 g，加適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至250 ml容量瓶中定容至刻度，搖勻后置于棕色試劑瓶。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于20.0 ml具塞試管中，各以水補至1.0 ml，加入1.0 ml 6%苯酚溶液，混勻，然后快速加入5.0 ml濃硫酸，使用漩渦振蕩器使反應(yīng)液混勻，然后將試管置于沸水浴中水解20 min，取出冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光度值。以甘露糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4樣品的測定

準(zhǔn)確稱取樣品0.200 0 g，用0.6%氫氧化鈉溶液溶解，并完全轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中定容，75℃水浴30 min，取出立即冷卻至室溫，過濾，棄去初濾液，取10 ml濾液到100 ml容量瓶中定容。取待測樣品溶液1.0 ml，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟，測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計算甘露聚糖含量。

計算公式：

X=C×10-3×0.9×100/M

式中：X——甘露聚糖含量（%）；

C——標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品甘露糖含量（μg/ml）；

M——樣品質(zhì)量（g）；

0.9——甘露糖換算為甘露聚糖的系數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1提取條件的確定

甘露聚糖中大量碳水化合物短鏈與多肽殘基上羥基結(jié)合，形成O-糖苷鍵，該鍵在堿性條件下很穩(wěn)定，不易斷裂，并且與甘露聚糖相連多肽為堿溶性，因此該復(fù)合物能以整體形式溶于堿性溶液中［7］。酵母葡聚糖是以β-（1，3）-D-葡聚糖為主鏈含有β-（1，6）分支的葡聚糖，或同時含有微量的β-1，6連接為主鏈的葡聚糖［8］，符合堿不溶于葡聚糖的結(jié)構(gòu)特征［9］。酵母β-D-葡聚糖的溶解性與幾丁質(zhì)的存在有著直接的關(guān)系［10］，Mol等在研究釀酒酵母時，發(fā)現(xiàn)在酵母細胞壁中含量不到2%的幾丁質(zhì)以共價鍵的形式與β-1，3葡聚糖相連，致使酵母β-D-葡聚糖變?yōu)閴A不溶性［11-13］。

因此，樣品需要先經(jīng)堿溶液提取處理后測定甘露聚糖含量，用以避免葡聚糖對檢測結(jié)果的干擾。

2.1.1堿液濃度的確定

NaOH的濃度對甘露聚糖的提取具有顯著的影響，堿液濃度高會使多糖降解，而且雜質(zhì)增多。試驗結(jié)果表明，NaOH的濃度為0.6%時提取效果最好。

表1　堿液濃度對吸光度的影響

2.1.2提取溫度的確定

溫度越高，多糖溶出就越多，當(dāng)浸提溫度達到75℃時，吸光度值趨于平穩(wěn)，表示此時的甘露聚糖溶出也較多。因此，水浸提的溫度選擇75℃。

表2　提取溫度對吸光度的影響

2.1.3提取時間的確定

延長提取時間有利于多糖的溶出，從表3數(shù)據(jù)可以看出，隨著浸提時間的增加，吸光度也在增大，但30 min以后，增加幅度比較緩慢。因此，為了提高工作效率，確定浸提時間以30 min為宜。

表3　提取時間對吸光度的影響

2.2測定條件的確定

2.2.1最大吸收波長的確定

取樣品1.0 ml，與苯酚-硫酸試劑顯色，以等量的蒸餾水作空白，紫外-可見光全波長掃描。由圖1可知，在490 nm處有最大吸收，所以選擇490 nm為測定波長。

圖1　400～600 nm波長掃描

2.2.2顯色溫度的確定

分別吸取50 μg/ml甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml于具塞試管中，依次加入苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，搖勻，分別在40、60、80℃和100℃下反應(yīng)20 min，取出冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光度值。

表4　顯色溫度對吸光度的影響

由表4可知，隨著反應(yīng)溫度的升高吸光度有增大的趨勢，所以選擇100℃作為最佳顯色溫度。

2.2.3顯色時間的確定

分別吸取50 μg/ml甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml于具塞試管中，依次加入苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，搖勻，在100℃條件下分別反應(yīng)0、5、10、15、20、25和30 min。取出冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光度值。

表5　顯色時間對吸光度的影響

由表5可知，反應(yīng)20 min后吸光度趨于平緩，所以選擇20 min為最佳顯色時間。

2.2.4硫酸添加方式的確定

試驗中硫酸的加入方式對測定結(jié)果有很大的影響。表6結(jié)果表明，垂直加入會造成測定結(jié)果出現(xiàn)較大波動，RSD 8.04%，重現(xiàn)性差；加入硫酸的同時旋轉(zhuǎn)比色管，讓硫酸能均勻的沿壁流下，RSD 1.06%，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

表6　硫酸添加方式對吸光度的影響

2.3檢測方法驗證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在490 nm波長處測定吸光度，以試劑空白作參比，試驗結(jié)果見表7。

表7　甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值

所得線性回歸方程：y=0.008 9x+0.001 5（相關(guān)系數(shù)r=0.999 5），表明甘露糖在該反應(yīng)體系符合朗伯-比爾定律。以吸光度為縱坐標(biāo)，甘露糖為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

2.3.2穩(wěn)定性驗證

連續(xù)2 h內(nèi)每隔30 min測吸光度，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在顯色120 min時間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好，結(jié)果見表8。

圖2　甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表8 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.3.3精密度驗證

按樣品測定方法，將50 μg/ml甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品溶液重復(fù)測定6次的RSD值分別為1.01%和1.06%，表明精密度良好（見表9）。

表9 精密度試驗結(jié)果

2.3.4重現(xiàn)性驗證（見表10）

精密稱取同一批次啤酒酵母細胞壁樣品5份，按樣品測定方法進行甘露聚糖含量的測定。計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，判斷方法的重現(xiàn)性。經(jīng)檢測酵母細胞壁甘露聚糖含量23.47%，RSD 1.31%，結(jié)果表明此方法具有良好的檢測重現(xiàn)性。

表10 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

2.3.5加標(biāo)回收率測定（見表11）

在加標(biāo)回收試驗中，以啤酒酵母細胞壁為底樣，加入不同量的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品進行試驗。見表11可知，該試驗方法的平均回收率為100.78%，RSD為2.23%，表明方法的準(zhǔn)確率較高。

3　結(jié)論

表11　加標(biāo)回收試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，樣品的前處理的最佳條件為NaOH濃度0.6%、浸提溫度75℃、浸提時間30 min；檢測測定波長為490 nm、反應(yīng)溫度100℃、反應(yīng)時間20 min，在20.00～90.00 μg/ml范圍內(nèi)吸光度與甘露糖含量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，平均回收率100.78%，RSD為2.23%。

苯酚-硫酸法測定啤酒酵母細胞壁中甘露聚糖含量的方法，具有操作簡單，并且重現(xiàn)性好，顯色穩(wěn)定，常規(guī)儀器即可完成檢驗工作。試驗中硫酸的加入方式對測定結(jié)果有很大影響，采用旋轉(zhuǎn)加入硫酸至比色管的方式，讓硫酸能均勻的沿壁流下探索，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確穩(wěn)定。

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（編輯：高雁，snowyan78@163.com）

Determination of mannosan in beer yeast cytoderm

Chen Zhiying，Jiang Jianmei，Xu Tingting，Shu Yuan，Chen Guanqing，Wu Zhen，Zhang Zijian

The method for quantitative determination of mannosan in beer yeast cytoderm was established successfully.Samples were extracted with alkali solution of mannan，on the basis of mannose，mannan content is determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the optimum extracting were extraction at temperature 75℃ for 30 min in 0.6%NaOH concentration.Results showed that under the conditions of detection wavelength 490 nm，reaction temperature 100℃and reaction time 20 min，there is good linearity range from 20.00～90.00 μg/ml（r=0.999 0）.The average recovery is 100.78%and the RSD is 2.23%.The assay method was proved to be simple，convenient，accurate with good reproducibility and can be used for the determ ination of beer yeast cytoderm.

beer yeast；cytoderm；mannosan；phenol-sulfuric acid method

10.13302/j.cnki.fi.2016.05.013

S816.32

A

1001-991X（2016）05-0056-04

陳志穎，研究方向為酵母深加工。

張子健，工程師，碩士。

2015-11-19

國家國際科技合作專項項目［2012DFA30390］