趙　昕，張廣春，陳明明，苑振廷，廖格斯

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復(fù)方元胡片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙昕1，張廣春1，陳明明1，苑振廷2，廖格斯1

1.沈陽(yáng)軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，沈陽(yáng) 110026；2.沈陽(yáng)軍區(qū)第二三零醫(yī)院，丹東 118000

[摘要]目的建立復(fù)方元胡片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法定性鑒別處方中的香附、延胡索，采用HPLC法測(cè)定延胡索乙素的含量。色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(40∶60)作為流動(dòng)相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)薄層色譜法斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；延胡索乙素在192～912 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：y=1.108 9 x-20.546，r=0.999 6，平均回收率為100.82%，RSD為1.27%(n=6)。結(jié)論本方法可有效控制復(fù)方元胡片的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方元胡片；薄層色譜法；HPLC法；延胡索乙素

0　引言

復(fù)方元胡片是中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)第230醫(yī)院配制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由海螵蛸、枯礬、香附、元胡和曼陀羅葉等五味中藥組成，具有甘熱胃溫、止酸收斂的功效，臨床上主要用于治療胃酸過(guò)多，胃炎及十二指腸潰瘍等疾病。其君藥元胡(延胡索)味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有活血、散瘀、行氣、止痛的功效?，F(xiàn)代研究表明，延胡索乙素作為延胡索的主要有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠等作用[1-3]。本文對(duì)香附與元胡(延胡索)進(jìn)行了顯微鑒別；對(duì)海螵蛸進(jìn)行了化學(xué)鑒別；采用薄層色譜法(TLC)對(duì)處方中的元胡(延胡索)、香附進(jìn)行了定性鑒別；采用HPLC法測(cè)定制劑中延胡索乙素的含量，為建立復(fù)方元胡片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(1260系列，Aglient公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(JASCO-930，大連遠(yuǎn)洋儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AG204電子天平(美國(guó)梅特勒公司)。

1.2試劑甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，磷酸(分析純)，三乙胺(分析純)，重蒸水(自制)。對(duì)照品：α-香附酮(中檢院，批號(hào)：110748-201312)；延胡索乙素(中檢院，批號(hào)：110726-201414)。樣品：復(fù)方元胡片(由沈陽(yáng)軍區(qū)第二三零醫(yī)院提供，批號(hào)：140414、140415、140416)。陰性對(duì)照樣品為自制。

2　方法與結(jié)果

2.1香附與元胡(延胡索)的顯微鑒別取本品，研細(xì)，置顯微鏡下觀察，表皮細(xì)胞多角形，常帶有下皮纖維及厚壁細(xì)胞。下皮纖維成束，深棕色或紅棕色(香附)；糊化淀粉粒團(tuán)塊淡黃色或近無(wú)色(延胡索)。見(jiàn)圖1。

圖1　顯微鑒別圖

2.2海螵蛸的化學(xué)鑒別取本品2片，研碎，滴加稀鹽酸，產(chǎn)生氣泡。見(jiàn)圖2。

圖2　海螵蛸化學(xué)反應(yīng)鑒別圖

2.3TLC鑒別

2.3.1元胡(延胡索)溶液的制備：①對(duì)照藥材溶液及對(duì)照品溶液：取延胡索對(duì)照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲30 min，過(guò)濾后所得濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用濃氨試液調(diào)至堿性，再加入二氯甲烷10 mL振搖提取，同法3次，合并提取液，蒸干，得殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得對(duì)照藥材溶液；取延胡索乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。②樣品溶液：取本品10片，研細(xì)，取2 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加濃氨試液調(diào)至堿性，用二氯甲烷10 mL振搖提取，同法3次，合并提取液，蒸干，得殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。③陰性溶液：按復(fù)方元胡片的制備方法制成缺元胡(延胡索)的片劑，再按上述“樣品溶液”制備方法制得陰性溶液。

TLC鑒別：吸取上述4種溶液各10 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為甲苯-丙酮(4∶1)，展開(kāi)，晾干后置碘缸中，約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘，置365 nm紫外光燈下檢視。樣品色譜與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的熒光斑點(diǎn)顯相同顏色，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　元胡薄層色譜鑒別(專(zhuān)屬性)

圖4　元胡薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.3.2香附溶液的制備：①對(duì)照品溶液：取α-香附酮對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，即得；②樣品溶液：取本品20片，研細(xì)，取粉末5 g，加二氯甲烷30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為樣品溶液。③陰性溶液：按復(fù)方元胡片的制備方法制成缺香附的片劑，再按上述“樣品溶液”制備方法制得陰性溶液。

TLC鑒別：吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，展開(kāi)劑為二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(90∶1∶1∶0.1)，展開(kāi)，取出，晾干，置254 nm紫外燈光下檢視。樣品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上顯相同的深藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5　香附薄層色譜鑒別(專(zhuān)屬性)

圖6　香附薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.4含量測(cè)定

2.4.1色譜條件色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(40∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算不低于2 000。

最大吸收波長(zhǎng)的選擇：精密稱(chēng)取延胡索乙素對(duì)照品適量，以流動(dòng)相為溶劑制成每1 mL含延胡索乙素48 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。將其置JASCO-530型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液在280 nm左右處有最大吸收。同時(shí)參考《中國(guó)藥典》2010版相關(guān)延胡索乙素含量測(cè)定的色譜條件[4]，本實(shí)驗(yàn)選定280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。紫外光譜圖見(jiàn)圖7。

圖7　延胡索乙素紫外光譜圖

2.4.2溶液的制備①對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取延胡索乙素對(duì)照品適量，加入甲醇制成每1 mL含延胡索乙素48 μg的溶液。②樣品溶液：取本品20片研成細(xì)粉，精密稱(chēng)取約4.0 g，加濃氨試液-甲醇(1∶20)50 mL，稱(chēng)定重量，冷浸1 h后，超聲30 min，放冷，用濃氨試液-甲醇(1∶20)補(bǔ)足重量，蒸干過(guò)濾后所得濾液，殘?jiān)蛹状既芙狻⒍ㄈ萦? mL容量瓶，搖勻，取過(guò)濾后的續(xù)濾液，即得。③陰性樣品溶液：按復(fù)方元胡片的制備方法制成缺元胡(延胡索)的片劑，再按上述“樣品溶液”制備方法制得陰性溶液。

2.4.3專(zhuān)屬性試驗(yàn)精密稱(chēng)取“2.4.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，見(jiàn)圖8。結(jié)果表明，延胡索乙素的保留時(shí)間約為27 min，陰性對(duì)照樣品不干擾延胡索乙素的測(cè)定，延胡索乙素與其他成分或雜質(zhì)的分離度>1.5，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)均不低于2 000，試驗(yàn)表明此法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖8　延胡索乙素高效液相色譜圖

2.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取不同體積的濃度為48 μg/mL延胡索乙素對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)操作，以測(cè)定峰面積值為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，得回歸方程：y=1.108 9 x-20.546，r=0.999 6(對(duì)照品進(jìn)樣量在192～912 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系)。

2.4.5精密度試驗(yàn)精密吸取“2.4.2”對(duì)照品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)操作，連續(xù)進(jìn)樣得峰面積RSD為1.92%(n=5)。

2.4.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取復(fù)方元胡片(批號(hào)：140416)，按照“2.4.2”制備樣品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)操作，分別在0、2、4、6、8 h測(cè)定延胡索乙素峰面積，測(cè)得其RSD為1.46%(n=5)，表明本溶液在8 h內(nèi)未曾分解，穩(wěn)定性良好。

2.4.7重復(fù)性試驗(yàn)取復(fù)方元胡片(批號(hào)：140416)6份，按照“2.4.2”制備樣品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)操作，測(cè)得延胡索乙素平均含量為43.3 μg/g，RSD為1.62%(n=6)，符合要求。

2.4.8回收率試驗(yàn)取復(fù)方元胡片(批號(hào)：140416)6份，每份約精密稱(chēng)取2.0 g，分別加入延胡索乙素對(duì)照品溶液(48 μg/mL)各2.0 mL，按照“2.4.2”制備樣品溶液，制成回收率用樣品溶液，再按“2.4.1”操作臺(tái)，測(cè)定樣品中延胡索乙素含量，算得平均回收率為100.82%，RSD為1.27%(n=6)，符合要求。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　回收率試驗(yàn)

2.4.9樣品測(cè)定取復(fù)方元胡片(批號(hào)：140414、140415、140416)，按照“2.4.2”制備樣品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)操作，分別測(cè)定其中延胡索乙素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

3.1樣品制備延胡索乙素為叔胺類(lèi)生物堿，呈弱堿性，在堿性環(huán)境下以分子形式存在，易溶于有機(jī)相[5-6]，在樣品溶液制備過(guò)程中，考察了超聲提取與回流2種提取方法，結(jié)果顯示，超聲提取方法既簡(jiǎn)便且提取效果最好。比較了甲醇、乙醇、60%甲醇、60%乙醇、濃氨-甲醇(1∶20)等不同提取溶劑，結(jié)果以濃氨-甲醇(1∶20)提取最為完全。故最終確定樣品處理方法為濃氨-甲醇(1∶20)超聲提取。

3.2流動(dòng)相的選擇對(duì)流動(dòng)相的種類(lèi)進(jìn)行了考察，選取了甲醇-水(55∶45)、甲醇-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(55∶45)、乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(55∶45)、乙腈-水(40∶60)、乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(40∶60)，最終選用乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至6.0)(40∶60)為流動(dòng)相能夠使延胡索乙素與雜質(zhì)完全分離，峰形好。

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收稿日期：2015-08-12

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603022

Study on quality standard for compound Yuanhu tablet

ZHAO Xin1，ZHANG Guang-chun1，CHEN Ming-ming1，YUAN Zhen-ting2,LIAO Ge-si1

(1.Institute for Drug and Instrument Control of Shenyang Military Region,Shenyang 110026,China; 2.No.230 Hospital of PLA,Dandong 118000,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the quality standard for compound Yuanhu tablet.MethodsRhizoma cyperi and Corydalis Rhizoma in the tablet were identified by TLC.The content of tetrahydropalmatine was determined by HPLC.A C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used with the mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% phosphoric acid (adjusting pH to 6.0 with triethylamin) (40∶60) at the column temperature of 30 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 280 nm.ResultsThe method of TLC had good resolution with clear spots and had interference from negative control.The good linearity was obtained within the range of 192～912 ng (y=1.108 9 x-20.546，r=0.999 6) for tetrahydropalmatine and the average recovery was 100.82% (RSD=1.27%,n=6).ConclusionThe established method is simple,accurate and sensitive,and can be applied in the quality control of compound Yuanhu tablet.

Key words：Compound Yuanhu tablet; TLC; HPLC; Tetrahydropalmatine