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(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷縣，030801)　(農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室(北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心))　(山西農(nóng)業(yè)大學(xué))

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東方百合‘索邦’基于噴霧式植物反應(yīng)器的AtCKX3基因轉(zhuǎn)化1)

張倩杜運鵬畢彧陳緒清張秀海楊秀云

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷縣，030801)(農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室(北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心))(山西農(nóng)業(yè)大學(xué))

摘要以東方百合‘索邦’鱗片為試材，采用噴霧式植物反應(yīng)器(即開放式培養(yǎng))手段，進行外源基因AtCKX3的轉(zhuǎn)化，并對除草劑草丁膦(PPT)質(zhì)量濃度篩選、轉(zhuǎn)化效率進行了研究。以生長情況一致的百合幼苗為材料進行草丁膦質(zhì)量濃度的篩選，結(jié)果表明：8.5 mg·L-1為‘索邦’草丁膦篩選的臨界質(zhì)量濃度；將農(nóng)桿菌侵染后的鱗片在噴霧式反應(yīng)器中培養(yǎng)，誘導(dǎo)出不定芽及生根后進行移栽，并對轉(zhuǎn)化植株幼苗進行草丁膦篩選。對抗性植株進一步進行PCR檢測和PCR-Southern雜交檢測，結(jié)果表明：采用噴霧式植物反應(yīng)器培養(yǎng)，一方面，可有效提高轉(zhuǎn)化效率，縮短培養(yǎng)時間，轉(zhuǎn)化率為0.29%左右；另一方面轉(zhuǎn)化苗移栽成活率更高，達(dá)75%。

關(guān)鍵詞百合；噴霧式植物反應(yīng)器；遺傳轉(zhuǎn)化；AtCKX3基因

百合(Lilium spp.)，百合科百合屬多年生草本球根植物，是世界六大鱗莖作物之一[1]，被廣泛應(yīng)用于切花、盆花和園林綠地，可觀賞，亦可食用和藥用，具有較大的經(jīng)濟價值。優(yōu)良百合新品種選育主要依賴于常規(guī)雜交，但遠(yuǎn)緣雜交出現(xiàn)受精障礙現(xiàn)象十分普遍[2]。此外，親本遺傳背景也是重要的制約因素。另一方面育種周期長，后代分離復(fù)雜，定向選育困難。而現(xiàn)代生物技術(shù)可彌補其不足，將育種材料并不存在的目的基因引入到受體植物，定向改良其性狀而不改變植株其他性狀[3]。分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展使通過基因工程手段改良百合品種提高百合品質(zhì)成為傳統(tǒng)育種方式的重要補充?；蚬こ碳夹g(shù)可將不同外源基因?qū)氲桨俸匣蚪M中，并使之穩(wěn)定遺傳，是短時期內(nèi)獲得新品種的安全有效的新途徑[4]。

目前，通過基因工程技術(shù)手段主要達(dá)到改變百合花色、花型，改善百合采后特性，提高百合抗逆性等目的，使用的外源基因有抗衰老基因、花色調(diào)控基因、抗病基因、抗蟲基因和抗病毒基因等。在提高百合植株抗逆性方面，陳莉[5]向麝香百合中導(dǎo)入耐熱基因Mn-SOD，經(jīng)過高溫脅迫處理，所得到的轉(zhuǎn)基因百合耐熱性有很大提高。Li et al.[6]將P5CS基因?qū)氲桨俸匣蚪M中成功獲得了抗鹽性強的轉(zhuǎn)化植株，除此之外，關(guān)于提高百合抗鹽性和抗旱性研究仍基本處于空白。因此，增強百合抗逆性對提高百合觀賞價值和品種改良意義重大，同時孕育著不容小覷的經(jīng)濟效益。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)選擇方面主要方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法?；驑尫ň哂袕V泛的靶受體類型和不受寄主范圍限制的優(yōu)點，但其成本高，試驗時重復(fù)率較差[7]。電擊法的特點是轉(zhuǎn)化效率相對較高，操作簡易，但由于百合原生質(zhì)體再生植株困難，且電擊會對原生質(zhì)體造成一定傷害，降低植板率，因此在百合上的應(yīng)用鮮有報道。以農(nóng)桿菌為載體進行外源基因轉(zhuǎn)化的方法因其低拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化效率高而被廣泛使用。雖然普遍認(rèn)為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中其有效寄主并不包括單子葉植物，但目前國內(nèi)外研究者已經(jīng)在包括百合在內(nèi)6個科部分單子葉植物中驗證了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可行性[8-9]。李邱華等[10]為了獲得百合無花粉品種，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化百合鱗片，將基因Zm401成功導(dǎo)入到新鐵炮百合中。南雪花[11]在雙價載體pBLGC轉(zhuǎn)化體系建立的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)化百合，并在轉(zhuǎn)化后的蘭州百合中檢測到了目的基因。劉偉[12]將IPT基因和NPR1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入亞洲百合‘布耐羅’，PCR檢測到目的基因，生理指標(biāo)檢測表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗衰老性、抗病性均有所提高。Mercuit et al.[13]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法向百合胚性愈傷組織中導(dǎo)入ROL基因，成功獲得了轉(zhuǎn)化植株。Pejman et al.[14]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法向L.‘Acapulco’中導(dǎo)入無毒CMV復(fù)制酶基因(CMV2-GDD)，獲得了CMV抗性很強百合植株。Qi et al.[15]將攜帶GUS基因的載體pCAMBIA1301利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功導(dǎo)入到由百合花絲和莖段誘導(dǎo)的胚性懸浮細(xì)胞中。

目前，百合轉(zhuǎn)基因遇到的瓶頸一方面百合基因組巨大，外源基因與受體基因組間的互作以及表達(dá)模式不清楚，基因的不表達(dá)可能是啟動子原因或受體基因組因素導(dǎo)致基因沉默。另一方面植物基因工程的基礎(chǔ)是建立穩(wěn)定高效的再生系統(tǒng)，需要通過組織培養(yǎng)或其他培養(yǎng)途徑，向受體細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA，使之接受外源基因的整合，但傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方式整個過程耗時長，需要在保證分化率的的情況下克服易污染問題，篩選周期長，對操作人員要求較高，工作量大，侵染數(shù)量有限，并且不易掌握。

針對這些瓶頸問題，本研究以噴霧式植物反應(yīng)器為基礎(chǔ)進行AtCKX3基因?qū)Π俸系霓D(zhuǎn)化。噴霧式植物反應(yīng)器(包括霧培箱、水箱、回收水箱和控制系統(tǒng))在開放環(huán)境下通過營養(yǎng)液霧化進行植物離體材料/組織的誘導(dǎo)反應(yīng)。與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法相比，具有開放式、大規(guī)模、移栽成活率高等特點。細(xì)胞分裂素氧化酶(CKX)是一類不可逆降解細(xì)胞分裂素氧化酶，影響許多植物細(xì)胞分裂素代謝，是代謝中的重要負(fù)調(diào)控因子之一，影響植物根部頂端分生組織的生長。AtCKX3也可能涉及參與相應(yīng)的鹽和干旱誘導(dǎo)機制的調(diào)控[16]。AtCKX基因在轉(zhuǎn)化植株側(cè)根原基中可促進側(cè)根的形成，根部顯著生長[17]，使植株抗逆性增強。而常用外植體之一的百合鱗片分化的不定芽的誘導(dǎo)率最高[18]，有很強再生能力。因此，本研究以東方百合‘索邦’為試材，以噴霧式植物反應(yīng)器為基礎(chǔ)，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染，將AtCKX3基因(根特異性啟動子EXP-18D驅(qū)動并促進其表達(dá))導(dǎo)入百合鱗片，探討進行百合遺傳轉(zhuǎn)化以及提高轉(zhuǎn)化效率的可能性，并獲得抗逆性強的轉(zhuǎn)基因種質(zhì)，從而為百合的遺傳轉(zhuǎn)化和抗逆性研究提供借鑒和參考。

1材料與方法

1.1材料

以東方百合品種‘索邦’(Sorbonne)鱗片為植物材料。

菌株為攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105(保存于本實驗室)。載體由北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心吳忠義老師構(gòu)建(圖1)。載體含有目的基因AtCKX3，bar基因為篩選標(biāo)記，具有草丁膦(PPT)抗性[19]。啟動子EXP18-D具有根特異性驅(qū)動表達(dá)的特點。

1.2草丁膦質(zhì)量濃度的篩選

取生長良好且生長狀況均勻一致的百合幼苗，將草丁膦噴施質(zhì)量濃度設(shè)置為A1(0 mg·L-1，為對照)、A2(4.5 mg·L-1)、A3(6.0 mg·L-1)、A4(8.5 mg·L-1)。每個處理45株幼苗，分別噴施后觀察并記錄幼苗葉片形態(tài)變化及生長情況以確定受毒害程度，從而確定百合幼苗對草丁膦的耐性，以篩選較適的質(zhì)量濃度。

1.3農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

挑取少許菌種，在添加50 mg·L-1利福平(Rif)與50 mg·L-1卡那霉素(Km)的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃暗培養(yǎng)。隨后挑取單菌落，接種于5～10 mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(AtCKX3菌液培養(yǎng)時需加入四環(huán)素(TC))，于搖床中200 r·min-1震蕩，過夜培養(yǎng)(28 ℃，黑暗)。

將搖好的菌液取適量(一般1 mL)置于LB+50 mg·L-1Rif+50 mg·L-1Km+5 mg·L-1TC的500 mL液體培養(yǎng)基中于搖床震蕩(28 ℃，200 r·min-1)暗培養(yǎng)，至生長對數(shù)期：OD600為0.6～1.0。

1.4外植體鱗片的預(yù)處理

將鱗片從百合鱗莖上剝下，挑取健壯、表面光潔、無病斑的中層百合鱗片，依次用洗潔精浸泡，流水沖洗，除去其表面泥垢，備用作轉(zhuǎn)化。

1.5侵染與轉(zhuǎn)化

將收集好的菌液分裝于50 mL離心管中，4 ℃，8 000r·min-1離心8 min，倒掉上清，回收菌體，向下層沉淀中加入少量改良的液體MS培養(yǎng)基：1/2MS(去除大量元素)+0.2 mg·L-1乙酰丁香酮(AS)+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，震蕩混勻使之重懸，將重懸液倒入無菌三角瓶中，繼續(xù)加入改良的液體MS培養(yǎng)基至重懸液OD600值達(dá)到0.6～1.0(加入的MS培養(yǎng)基體積和菌液體積大致相同即可)。將處理好的百合鱗片在上述重懸菌液中侵染15～20 min，后晾干，將其擺放于底部鋪有紗布和經(jīng)過消毒的陶粒的深色培養(yǎng)盒中，使鱗片基部接觸陶粒和共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1AS)。于恒溫箱中28 ℃暗培養(yǎng)3 d(圖2B)。

1.6轉(zhuǎn)化鱗片的誘導(dǎo)分化與再生

將共培養(yǎng)后的鱗片(凹面朝上)放置于噴霧式反應(yīng)器內(nèi)采用營養(yǎng)液霧化方式培養(yǎng)，進行百合鱗莖不定芽誘導(dǎo)(圖2C)。4次·d-1定時噴灑液體培養(yǎng)基30 mg·L-1MS+5 mg·L-16-BA+1 mg·L-1NAA+多菌靈800倍液。

A.噴霧式植物反應(yīng)器;B.共培養(yǎng)中的百合鱗片;C.侵染后的鱗片于噴霧式植物反應(yīng)器中分化不定芽。

圖2侵染后的百合鱗片

1.6.1抗性篩選

60 d后將噴霧式反應(yīng)器中分化生根幼苗移栽并進行抗性苗草丁膦的篩選。對移栽后生長良好的百合幼苗葉面均勻噴施篩選質(zhì)量濃度的草丁膦。觀察噴施后的植株葉片顏色變化，若生長狀態(tài)正常，則認(rèn)為此植株為抗性植株;若噴施后葉片枯黃并脫落，則為非抗性植株。

1.6.2抗性植株的PCR檢測

提取抗性植株的DNA(TIANGEN試劑盒)，根據(jù)AtCKX3基因序列和bar基因序列，用primer premier 6.2設(shè)計引物進行PCR檢測。

上游引物：5’-GGA GTT GAG CCT GTT GTA GTT AG-3’

下游引物：5’-GGT TGT GGT GAT GTG TTG GTT-3’

25 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，基因組DNA 1 μL，兩種引物各1 μL，LA Taq酶0.2 μL，dNTP Mix 2 μL，ddH2O 17.3 μL。

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，隨后57 ℃退火1 min，72 ℃延伸150 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 2 min。目的片段大小為1 426 bp，反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.6.3PCR-Southern

將PCR產(chǎn)物100 ℃消煮10 min后立即放于冰上5 min。AtCKX3基因和bar基因的PCR產(chǎn)物作為雜交探針，按照羅氏DNA-Southern雜交試劑盒說明進行。

1.6.4轉(zhuǎn)化植株與非轉(zhuǎn)化植株根長比較

對轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株進行根長的測量，每組各3個重復(fù)，進行統(tǒng)計，計算平均根長并進行比較。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

按以下公式計算移栽成活率，PCR陽性率，轉(zhuǎn)化效率：

移栽成活率=(移栽成活的株數(shù)/移栽幼苗數(shù))×100%；

PCR陽性率=(PCR檢測的陽性植株/抗性植株數(shù))×100%；

轉(zhuǎn)化率=(轉(zhuǎn)化植株數(shù)/總的鱗片處理數(shù))×100%。

用SPSS 18.0進行顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1草丁膦質(zhì)量濃度的篩選

百合植株對草丁膦的耐受程度可直接從噴施后植株葉片顏色、形態(tài)變化以及生長情況反應(yīng)出來。由表1可知，與對照相比，當(dāng)噴施草丁膦質(zhì)量濃度為4.5 mg·L-1時，葉片枯萎發(fā)黃的植株數(shù)量較少，少數(shù)植株生長受到抑制，葉片死亡率為24.200%。而隨著噴施質(zhì)量濃度的增加，出現(xiàn)毒害現(xiàn)象的百合葉片數(shù)顯著增多，生長受到的抑制作用也逐漸增加。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到8.5 mg·L-1時，黃化率達(dá)到89.800%，幼苗生長受到明顯抑制，甚至個別幼小植株逐漸出現(xiàn)枯萎死亡現(xiàn)象(圖3)。由此可見，草丁膦噴施的臨界質(zhì)量濃度為8.5 mg·L-1。

表1　百合幼苗草丁膦質(zhì)量濃度的篩選

圖3　百合幼苗草丁膦質(zhì)量濃度的篩選

2.2百合抗性植株的檢測

2.2.1抗性植株的PCR檢測

對噴施過除草劑所篩選出生長情況基本良好的65株百合抗性植株進行PCR檢測，檢測結(jié)果表明，其中有3株含有AtCKX3基因的目的條帶，如圖4所示，初步證明外源基因AtCKX3已經(jīng)整合到百合基因組中。

M.DL2000 Marker；1.ddH2O對照；2.陰性對照；3.陽性對照；4～6.抗性植株。

圖4抗性植株AtCKX3基因PCR檢測

2.2.2抗性植株的PCR-Southern檢測

根據(jù)PCR檢測結(jié)果，對含有AtCKX3基因的3株陽性植株進行進一步以AtCKX3基因為探針的PCR-Southern檢測。

由圖5可知，結(jié)果出現(xiàn)雜交條帶，進一步證明外源基因已整合到受體植株基因組中，結(jié)果為陽性，陽性率為4.6%，占鱗片總處理數(shù)1030個的0.29%。

1.陽性對照；2.陰性對照；3～4.PCR陽性植株。

2.3轉(zhuǎn)化植株根系狀況

測量轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株根系長度并進行比較(表2)，測量結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)化植株根系平均長度為7.67 cm；轉(zhuǎn)化植株的根系長度平均為16.56 cm，顯著高于未轉(zhuǎn)化植株根系平均長度，且側(cè)根數(shù)有明顯增加(圖6)。

表2　轉(zhuǎn)化植株與非轉(zhuǎn)換植株根系平均長度

注：同列不同字母表示差異顯著。

CK.對照；1～3.轉(zhuǎn)化植株。

3結(jié)論與討論

本研究針對百合的轉(zhuǎn)基因瓶頸，一方面探討了基于噴霧式植物反應(yīng)器的百合遺傳轉(zhuǎn)化方法，提高了百合的轉(zhuǎn)化效率；另一方面，為了獲得抗逆新種質(zhì)，提高百合抗逆性，選用從擬南芥中克隆的AtCKX3基因，成功導(dǎo)入到百合基因組中，獲得了轉(zhuǎn)化植株。下一步將擴大規(guī)模，開展轉(zhuǎn)化植株田間抗旱性的鑒定等工作，以期更全面地為提高百合的轉(zhuǎn)化效率及抗逆性研究提供參考。

載體的表達(dá)直接影響外源基因的表達(dá)。表達(dá)不同的基因需要不同水平的啟動子[20]。非組成型啟動子可在部分植物器官組織中或一些特定條件下特異性地啟動目的基因的表達(dá)。本研究采用根特異性啟動子EXP-18D，使目的基因AtCKX3在其驅(qū)動下啟動并促進在轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株的根系確有明顯伸長和側(cè)根的增多。

傳統(tǒng)組培方式需在無菌條件下開展，工作量大，而且污染率高，侵染數(shù)量有限，移栽成活率較低，而基于噴霧式植物反應(yīng)器的百合遺傳轉(zhuǎn)化方法可實現(xiàn)材料的大批量遺傳轉(zhuǎn)化?？捎行Ы鉀Q鱗片從外植體到獲得無菌苗的易污染問題，易于縮短整個轉(zhuǎn)化過程的時間并降低對操作條件的要求，操作簡便，易于掌握，利于降低成本。而且幼苗移栽成活率較高，將由分化出的不定芽所生長成的幼苗進行移栽，成活率可達(dá)75%。本試驗基于噴霧式植物反應(yīng)器對百合鱗片進行轉(zhuǎn)化，獲得了陽性植株3株，轉(zhuǎn)化率為0.29%，與王莎莎[21]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的索邦鱗片轉(zhuǎn)化率0.33%持平。因此，基于噴霧式植物反應(yīng)器的遺傳轉(zhuǎn)化方法是可行的，且在相近轉(zhuǎn)化率的前提下，可以大批量操作，縮短轉(zhuǎn)化周期。

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第一作者簡介：張倩，女，1990年9月生，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:zqianabc@163.com。 通信作者：楊秀云，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:xyyang2002@yeah.net。

收稿日期：2015年11月26日。

分類號Q943.2;Q949.71+8.23

AtCKX3 Transformation for Oriental Lily ‘Sorbonne’ Based on the Spray Plant Bioreactor//

Zhang Qian(Shanxi Agriculture University, Taigu 030801, P.R.China); Du Yunpeng, Bi Yu, Chen Xuqing, Zhang Xiuhai(Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology (Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences); Yang Xiuyun(Shanxi Agriculture University)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：59-63.

To get the higher genetic transformation frequency and obtain Lilium germplasm with good stress resistance, we used a new Agrobacterium-mediatied transformation method with spray plant reactor, an open cultivation system.The scales of Oriental hybrid ‘Sorbonne’ were used as the gene receptors of exogenous gene AtCKX3.We studied the herbicide phosphinothricin (PPT) concentration screening, transformation efficiency.The 8.5 mg·L-1(PPT) was optimal to screen seedling.After the agrobacterium infection and co-cultivation, the scales were placed in the spray bioreactor to induce adventitious buds and roots.The transformed plants were transferred and screened.We analyzed the putatively transformed plantlets by PCR and PCR-southern blotting.The results demonstrate that open culture is available to improve genetic transformed frequency of 0.29%, and the transformed transplanting survival rate is higher, reaching to 75%.

KeywordsLilium； Spray plant bioreactor； Genetic transformation； AtCKX3 gene

1)“863”計劃項目(2013AA102706)、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20140202)。

責(zé)任編輯：任俐。