齊雯雯　宮曉琳　王洋　吳瑩

摘要 植物遺傳轉(zhuǎn)化是基礎(chǔ)理論研究和農(nóng)作物性狀改良的必要手段。隨著蘸花法在十字花科植物中的成功應(yīng)用被越來越多的學(xué)者關(guān)注，并用于許多模式植物及農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化。蘸花法簡便、高效、穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)化后可直接獲得轉(zhuǎn)基因種子。該文介紹了蘸花法的原理，分析影響轉(zhuǎn)化效率的因素，并總結(jié)了目前已成功應(yīng)用蘸花法的研究情況及篩選轉(zhuǎn)基因后代的優(yōu)化方法。

關(guān)鍵詞 遺傳轉(zhuǎn)化；蘸花；轉(zhuǎn)化效率；篩選

中圖分類號 Q-33 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2014）24-0009-02

遺傳轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。早期的轉(zhuǎn)化技術(shù)如葉盤法、共培養(yǎng)法均涉及到植物組織培養(yǎng)和再生，體細胞易變異產(chǎn)生不利影響[1]。Feldmann于1987年首次提出原位滲透轉(zhuǎn)化法，用農(nóng)桿菌浸染剛萌發(fā)的擬南芥種子并篩選出轉(zhuǎn)化陽性植株，避免了組織培養(yǎng)[2]。隨后，Bechtold在原位滲透轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)上建立了真空滲透法（vacuum infiltration），用處于花期的植株取代種子，倒置于農(nóng)桿菌菌液，同時抽真空處理，轉(zhuǎn)基因效率明顯提高[3]。1998年，Clough和Bent在菌液中加入表面活性劑Silwet L-77，取消抽真空，建立了蘸花法（floral dip），其轉(zhuǎn)化效率與真空滲透法相近[4]。Chung等發(fā)現(xiàn)噴霧（floral spray）處理可代替浸蘸花器，在保障轉(zhuǎn)化效率的前提下擴大了應(yīng)用范圍[5]。蘸花法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化后可直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，避免了體細胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)的過程及移栽成活率低等問題。該文介紹蘸花法原理，總結(jié)轉(zhuǎn)化效率影響因素的優(yōu)化方案及轉(zhuǎn)基因后代的篩選方法，為應(yīng)用蘸花法進行遺傳轉(zhuǎn)化提供重要的技術(shù)策略。

1 轉(zhuǎn)化機理

研究表明，T-DNA攜帶的目的基因是異源插入[3]。擬南芥自花授粉，異源插入可能發(fā)生于花發(fā)育后期。Desfeux等單獨浸染擬南芥的雄蕊和雌蕊，在雌蕊后代中檢測到轉(zhuǎn)化株，而雄蕊后代中未發(fā)現(xiàn)，表明雌蕊是轉(zhuǎn)化的受體[6]。農(nóng)桿菌浸漬處理后，GUS染色發(fā)現(xiàn)胚珠顯色，而花粉和花藥未顯色，說明轉(zhuǎn)化的有效部位為雌配子體，但不排除雄配子體存在小概率轉(zhuǎn)化[6]。擬南芥的子房室不總關(guān)閉，卵細胞發(fā)育突出，會延伸成瓶狀結(jié)構(gòu)并在頂部開口，花發(fā)育后期子房室頂部閉合。轉(zhuǎn)化一般在花芽形成前5～10 d進行，此時雌蕊開放，農(nóng)桿菌進入子房并將T-DNA轉(zhuǎn)移到卵細胞[7]。

2 影響蘸花法轉(zhuǎn)化效率的因素

蘸花法轉(zhuǎn)化效率受多重因素影響，且在不同物種間存在差異。近年來，關(guān)于蘸花法影響因素分析的報道增多，已在擬南芥[4-7]、甘藍型油菜[8-9]、苜蓿[10]等不同的物種中分析了農(nóng)桿菌、蔗糖、表面活性劑、浸染次數(shù)及間隔等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響（表1）。

2.1 植物發(fā)育時期

蘸花法需在長出花序的植株上進行，多數(shù)植物以初花期為最佳轉(zhuǎn)化時期。擬南芥在主枝切除、次級分枝僅有少許花開放時轉(zhuǎn)化效率最高[4]；白菜的最適浸染時期為花薹抽出期[16]；甘藍型油菜花薹抽出時，摘除主薹1周后浸染最適[8]；蘿卜浸染的最適時期為初薹發(fā)育期[14]。

2.2 表面活性劑的種類及用量

表面活性劑有很強的吸附性和滲透能力，能減少液體的表面張力，利于農(nóng)桿菌的吸附。Clough等加入0.02%的Silwet L-77使轉(zhuǎn)化效率提高2倍[4]。Curtis等用含有3種不同表面活性劑的菌液轉(zhuǎn)化蘿卜，對比得出Silwet L-77轉(zhuǎn)化效率最佳，Pluronic F-68次之，Tween 20最低[14]。Mireault等用XIAMETER OFX-0309代替Silwet L-77，使轉(zhuǎn)化效率提高了3倍[19]。表面活性劑濃度過高對植株有明顯的傷害，可致植株枯萎，Silwet L-77的濃度建議為0.02%～0.05%，不應(yīng)超過0.1%。

2.3 蔗糖濃度

蔗糖能保持花粉內(nèi)外壓強一致，并為轉(zhuǎn)化提供能量，利于農(nóng)桿菌在受體表面生存。蔗糖還能誘導(dǎo)vir基因的表達，利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化[1]。蔗糖濃度過高會導(dǎo)致細胞失水，嚴重時細胞死亡。Clough等發(fā)現(xiàn)無蔗糖時蘸花法轉(zhuǎn)化效率極低，蔗糖濃度為10%時轉(zhuǎn)化效率最高，但結(jié)合轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，建議蔗糖濃度為5%[4]?？捎檬秤眉壵崽腔蚱咸烟谴嬖噭┘壵崽且怨?jié)約成本。

2.4 浸漬時間、次數(shù)

Chung等發(fā)現(xiàn)浸漬時間由5 s延長至5 min會使轉(zhuǎn)化效率提高2倍[5]，但浸漬時間過長會影響花序成活率。Clough等試驗表明，3次浸漬比單次處理的轉(zhuǎn)化效率提高1倍[4]。多次浸漬處理的轉(zhuǎn)化效率較高，是由于農(nóng)桿菌在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化反復(fù)發(fā)生，其活性會隨時間的延長而下降，多次浸漬可增加活性農(nóng)桿菌的數(shù)目，進而提高轉(zhuǎn)化效率。Clough等發(fā)現(xiàn)，2次浸漬的間隔少于4 d或超過2周均會給轉(zhuǎn)化植株造成不利影響[4]。因此，應(yīng)結(jié)合植株的生長狀態(tài)來確定最佳的浸漬時間、次數(shù)及間隔。

2.5 其他因素

Miguel等把農(nóng)桿菌的OD600從0.8提高到2.0，其轉(zhuǎn)化效率從2%提高到3%，說明適度提高農(nóng)桿菌的細胞密度可提高轉(zhuǎn)化效率[11]。農(nóng)桿菌菌株的類型對轉(zhuǎn)化效率有影響[20]，試驗表明，農(nóng)桿菌GV3101的轉(zhuǎn)化效率高于LBA4404[13]。浸漬試驗多選擇在溫度較低的時段進行，利于T-DNA整合入植物細胞。接種后用塑料膜覆蓋保濕，利于菌液和植物充分接觸，時間控制在12～24 h。接種方式有多種，針對不方便倒置浸漬的植物，可用微量進樣器將滲透緩沖液逐滴加到花序[15]，或用注射器將緩沖液注入花苞[18]；需大批量轉(zhuǎn)化可用噴霧法[21]，但滲透緩沖液對身體有害，需注意安全防護；而轉(zhuǎn)化效率較低的物種，可在蘸花時用抽真空輔助[4]。

3 蘸花法轉(zhuǎn)化后代的篩選與鑒定

蘸花法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化，外源DNA可整合入受體細胞?？筛鶕?jù)浸漬時菌株質(zhì)粒所攜帶的標記基因確定篩選方案，通過觀察植株狀態(tài)確定轉(zhuǎn)化株；也可PCR鑒定標記基因或GUS染色，確定轉(zhuǎn)化株及轉(zhuǎn)化效率。Clough等將轉(zhuǎn)化后的T0代擬南芥種子消毒并播種到含有適量卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選，并提取轉(zhuǎn)化株的基因組DNA進行雜交檢測確定轉(zhuǎn)化效率[4]。Cao等用草丁膦篩選小白菜轉(zhuǎn)化后代，并PCR鑒定C58質(zhì)粒上的virG 基因確定轉(zhuǎn)化株[22]。為減少篩選時間以提高效率，Harrison等調(diào)整培養(yǎng)光照時間，將篩選時間由7～10 d縮短為3.25 d[23]。Davis等用色譜沙篩選轉(zhuǎn)化后代，無需對種子消毒，節(jié)省了時間和成本且避免污染[24]。

4 蘸花法的應(yīng)用與展望

近年來，蘸花法轉(zhuǎn)化的相關(guān)報道逐漸增多。隨著蘸花法的改進，已在基因工程等領(lǐng)域廣泛運用，如T-DNA轉(zhuǎn)移及整合、基因的功能分析、突變體庫的構(gòu)建等[25-26]。該方法在多個物種中成功應(yīng)用，其中除了蘿卜[14]、鹽芥[17]等十字花科植物，還包括重要的農(nóng)作物如小麥[12]和經(jīng)濟作物如豆科植物[10，13]等。由于技術(shù)方法的限制，蘸花法仍有不足，如目前沒有通用的組合方案，轉(zhuǎn)基因后代需自交篩選獲得純合體等。因此，進一步完善蘸花法技術(shù)體系可為植物轉(zhuǎn)基因研究提供更多便利，為提高農(nóng)作物抗逆性、抗蟲害、抗病性等提供有效途徑。

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