王沛文+朱文哲+劉陽(yáng)+李景富+陳宏宇+陳秀玲+王傲雪

摘要：番茄在氣溫低于12 ℃時(shí)即不能正常開花結(jié)實(shí)，因此番茄生產(chǎn)受到了很大限制。多毛番茄是一種野生番茄，具有耐低溫甚至抗凍的特性，短暫遭受0 ℃的低溫，仍能正常開花結(jié)實(shí)。構(gòu)建了多毛番茄冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入番茄中，獲得8株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)冷誘導(dǎo)處理后，丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（ O-2 · ）含量均低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性則高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨砻鬓D(zhuǎn)多毛番茄CBF1基因（ShCBF1）可以提高番茄的抗冷性。

關(guān)鍵詞：多毛番茄;CBF1轉(zhuǎn)錄因子;耐冷性;番茄;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S641.201 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0030-06

收稿日期：2014-05-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（編號(hào)：31301780）;教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：211043）;黑龍江省博士后基金（編號(hào)：LBH-Z12044）;黑龍江省高校寒地蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金（編號(hào)：CVB2012-005）。

作者簡(jiǎn)介：王沛文（1990—），男，內(nèi)蒙古人，碩士，從事蔬菜分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：1009934259@qq.com。

通信作者：王傲雪，博士，教授，從事植物分子生物學(xué)方面研究。E-mail：wangaoxue@yahoo. com。

番茄是一種重要的蔬菜作物，在世界各地均有栽培，但在生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常遭受低溫冷害，因而降低了經(jīng)濟(jì)效益，影響番茄生產(chǎn)。而多毛番茄是一種野生番茄，屬番茄屬[1]，相關(guān)研究表明，它具有耐低溫甚至抗凍的特性[2]。多毛番茄葉片表面有厚密的絨毛，而普通番茄不具備此特點(diǎn)，推測(cè)多毛番茄表面的絨毛可能在一定程度上提高了其耐冷能力[3]。然而多毛番茄只有作父本和栽培番茄雜交才能坐果，而且果實(shí)結(jié)籽率低，轉(zhuǎn)育雜交困難[4]，限制了其作為育種材料的應(yīng)用。多毛番茄的高耐冷性不僅與膜脂相變程度小、膜結(jié)構(gòu)的調(diào)整能快速適應(yīng)低溫、代謝調(diào)整等一些生理生化變化有關(guān)[5]，同時(shí)也受CBF1基因的誘導(dǎo)[6]。

CBF（CRT/DRE binding factor）基因是一種抗冷（凍）轉(zhuǎn)錄因子，CBF基因首先在擬南芥中被克隆出來(lái)[7]。該基因通過(guò)調(diào)動(dòng)一系列的冷害相關(guān)（COR）基因完成植株的抗冷機(jī)制[8]。對(duì)多毛番茄而言，它的CBF1基因與普通番茄的CBF1基因同源性很高，但是普通番茄為冷敏植物，不具備耐冷性，多毛番茄耐冷性卻很強(qiáng)。推其原因，可能是多毛番茄CBF1基因下游的耐冷相關(guān)基因的分布和普通番茄不同，導(dǎo)致多毛番茄CBF1基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控作用強(qiáng)于普通番茄。

在擬南芥中過(guò)量表達(dá)CBF1基因，植株的抗寒能力明顯提高，不僅能提高COR蛋白的含量，而且大幅提高可溶性糖和脯氨酸含量[9-11]。Hsieh等將擬南芥的CBF1基因轉(zhuǎn)入番茄后，使番茄植株的CAT活性增強(qiáng)、脯氨酸含量增加，在干旱條件下比野生番茄植株表現(xiàn)更強(qiáng)的抗旱能力[12]。本研究從具有強(qiáng)抗冷性的野生番茄中克隆得到的CBF1轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到番茄中，并探討了轉(zhuǎn)基因植株的抗冷性及生理生化變化，獲得了抗寒力增強(qiáng)的番茄新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多毛番茄LA1033來(lái)自番茄遺傳資源中心（tomato genetic resource center，TGRC），普通番茄Micro-Tom由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 PMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司（大連）。植物表達(dá)載體p（h+p）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌EHA105由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供。

1.1.3 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)于大連TaKaRa公司，T4連接酶、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Km）購(gòu)自 Promega 公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他試劑均國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

番茄再生體系利用現(xiàn)有的成熟體系，具體如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物及PCR反應(yīng)條件 根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆的多毛番茄LA1033的CBF1基因序列（GenBank 登錄號(hào)GU129699）設(shè)計(jì)特異引物，在引物兩端添加適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，便于載體構(gòu)建。引物設(shè)計(jì)應(yīng)用primer 5.0軟件進(jìn)行，合成由上海生物工程有限公司完成。ShCBF1up為5′-GT GGATCCACCATGAATATCTTCGAAACC-3′（斜體為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），ShCBF1down為5′-GCGGTACCTTAGATGGAATAATTCC-3′（斜體為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）。

表1 番茄Micro-Tom的再生體系

培養(yǎng)基 成分

無(wú)菌苗培養(yǎng)基A O+15 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂（pH=5.8）

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基B O+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1.0 mg/L BAP+1.0 mg/L NAA（pH=5.8）

共培養(yǎng)培養(yǎng)基C O+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+1.0 mg/L BAP+1.0 mg/L NAA（pH=5.8）

芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基D O+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+2 mg/L Zeatin*+500 mg/L Cef+50 mg/L Km（pH=5.8）

芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基E O+15 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+1.0 mg/L Zeatin+500 mg/L Cef+50 mg/L Km+1.0 mg/L GA（pH=5.8）

生根培養(yǎng)基 F O+15 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+2.0 mg/L IBA+500 mg/L Cef+50 mg/L Km+1.0 mg/L GA（pH=5.8）

注：*前2周用2 mg/L Zeatin，以后Zeatin的濃度減半;O為4.3 g/L MS。

以多毛番茄LA1033葉片總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模版，引物ShCBF1up和ShCBF1down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為20 μL：含有2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL Mg2+（25 mmol/L），0.4 μL dNTP （10 mmol/L），上下游引物各1 μL （10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL模板cDNA，12.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35次循環(huán);最后72 ℃，保溫10 min，反應(yīng)產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 ShCBF1表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增得到的ShCBF1經(jīng)膠回收純化后與PMD18-T載體（TaKaRa公司）連接，利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂板后37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白斑進(jìn)行PCR初篩和質(zhì)粒酶切鑒定，得到含有ShCBF1基因的陽(yáng)性克隆。將鑒定為陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)化子（PMD-1033CBF1）送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證目標(biāo)基因的準(zhǔn)確性。

ShCBF1植物表達(dá)載體基于載體p（h+p）進(jìn)行構(gòu)建，首先合成接頭adapter1（5′-CGTACGTGAGCT- 3′）和adapter2（5′-CATGGCATGCAC 3′），adapter1和adapter2在65 ℃下孵育10 min后，可形成1個(gè)兩端分別是KpnⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的黏性末端的接頭。該接頭在T4連接酶的作用下與其他片段進(jìn)行連接反應(yīng)。利用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切PMD-1033CBF1質(zhì)粒，得到ShCBF1基因。用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒p（h+p），回收10 kb左右的載體片段。將目的基因、載體片段及合成好的接頭用T4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含有Km抗性的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR初步檢測(cè)，并做好標(biāo)記。然后在PCR成功的單菌落處再挑1次搖菌，提取質(zhì)粒DNA，用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒。鑒定重組體中ShCBF1基因片段插入的正確性，將得到的重組質(zhì)粒命名為pCAMhp1033CBF1。凍融法將質(zhì)粒pCAMhp1033CBF1導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，PCR檢測(cè)后待用。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化 無(wú)菌苗獲得：將番茄品種Micro-Tom的種子經(jīng)挑選后，用70%無(wú)水乙醇浸泡30 s，然后用10%次氯酸鈉（NaClO）消毒15 min，其間不斷搖動(dòng)，再用無(wú)菌水清洗3～4次后，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶15～20粒，置于（26±2） ℃（16 h光照，8 h黑暗）培養(yǎng)，光照度 1 600～1 800 lx。待子葉展開時(shí)，在無(wú)菌條件下切下子葉放在B培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24 h，即可用于農(nóng)桿菌侵染。

農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：挑取YEP平板上的單菌落，接種于10 mL含相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，菌液長(zhǎng)至D600 nm=0.5左右時(shí)，按1 ∶ 10的比例稀釋菌液，再搖菌進(jìn)行二次活化，搖約8～10 h至菌液D600 nm=0.5左右時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)入離心管，然后4 ℃、4 000 r/min離心 10 min，收集細(xì)菌細(xì)胞，用2%MSO液體培養(yǎng)基懸浮沉淀至D600 nm=05，該菌液作為轉(zhuǎn)化用菌液，對(duì)番茄葉片外植體進(jìn)行侵染。

侵染和共培養(yǎng)：將外植體放入已用2%MSO液體培養(yǎng)基懸浮好的菌液侵染預(yù)培養(yǎng)24 h的子葉20 min，其間輕輕搖動(dòng)，浸染完之后將番茄葉盤背面向上放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基C中共培養(yǎng)48 h。

外植體的篩選：外植體篩選利用卡那霉素，篩選壓力為50 mg/L，設(shè)對(duì)照為未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的子葉外植體放置到D培養(yǎng)基中，這些子葉應(yīng)該被卡那霉素殺死。已侵染的并共培養(yǎng)48 h的外植體也轉(zhuǎn)移置D培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。

外植體的繼代：每隔2周將D培養(yǎng)基中的外植體繼代1次，在此期間葉原基大概在2周內(nèi)就形成了，將形成葉原基的外植體切成小塊轉(zhuǎn)移到E培養(yǎng)基中，每隔2周或間隔更短時(shí)間繼代1次。經(jīng)過(guò)2～3周E培養(yǎng)基的繼代和篩選。3種類型的繼代外植體被區(qū)分出來(lái)并分別轉(zhuǎn)入不同的培養(yǎng)基：具有1 cm長(zhǎng)的形狀良好的芽的外植體轉(zhuǎn)移置E培養(yǎng)基中;致密的、綠色的外植體（有或沒(méi)有綠色的原基和小的不定芽）轉(zhuǎn)到含1 mg/L玉米素的D培養(yǎng)基;黑色或棕色的外植體已被卡那殺死，組織疏松的白色的外植體沒(méi)有分生能力，這2種外植體都應(yīng)丟棄。

生根培養(yǎng)和馴化移栽：當(dāng)芽長(zhǎng)置2～4 cm時(shí)切離外植體，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基F中。植株長(zhǎng)到5 cm可馴化移栽到土中。將轉(zhuǎn)基因植株從三角瓶中取出，用自來(lái)水洗掉植株根部的瓊脂，然后移栽到裝有濕潤(rùn)土壤的營(yíng)養(yǎng)缽中。再把營(yíng)養(yǎng)缽放在淺盤中用自來(lái)水充分浸透營(yíng)養(yǎng)缽中的土壤。將淺盤用透明的塑料膜罩上，以保證較高的濕度。5～7 d后撤掉塑料膜，施水肥，植株長(zhǎng)置10 cm定植到溫室。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) CTAB法提取轉(zhuǎn)化獲得的番茄幼苗的基因組DNA，根據(jù)NptⅡ序列設(shè)計(jì)引物NptⅡup 5′-ACTGGGCACAACAGACAA-3′和NptⅡdown 5′-CCGTAAAGCACGAGGAA-3′。以基因組DNA模板、NptⅡ上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以未轉(zhuǎn)基因的番茄植株為陰性對(duì)照，質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫性檢測(cè) 低溫對(duì)植物造成的影響主要是對(duì)植物細(xì)胞的生理生化特性產(chǎn)生影響，比如細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化作用、細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)以及細(xì)胞的脂類物質(zhì)發(fā)生變化等。為了初步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫性，選取陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ShCBF1植株和對(duì)照植株的幼苗，置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，22～25 ℃、光照16 h/d，在6張真葉時(shí)用于低溫脅迫處理。將轉(zhuǎn)基因植株株系TS-1、TS-2植株和對(duì)照植株（CK）在5 ℃條件下處理，分別在處理后0、24、36、48、96、144 h取樣，測(cè)定并分析轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株間的丙二醛（MDA）含量、超氧自由基（ O-2 · ）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性等各項(xiàng)指標(biāo)。測(cè)定方法參照朱文哲等的方法（2011），同時(shí)比較轉(zhuǎn)基因與為轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 多毛番茄CBF1基因的pCAMhp1033載體構(gòu)建

用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒PMD-1033CBF1，回收700 bp左右的1033CBF1基因片段，同時(shí)，用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒p（h+p），回收10 kb左右的載體片段（圖1）。將這2個(gè)片段與已連接好的KpnⅠ、SacⅠ接頭一起用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化。

經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定，均得到預(yù)期目的片段，證明植物表達(dá)載體pCAMhp1033CBF1構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 植物表達(dá)載體pCAMhp1033轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

采用凍融法將已構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMhp1033導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Rif和Km的YEP固體平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后長(zhǎng)出菌落，隨機(jī)挑取菌落進(jìn)行ShCBF1基因的PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)化的菌落可擴(kuò)增出約700 bp左右特異的目的基因片段（圖3），表明得到了完整的Ti質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)。因?yàn)橹苯犹崛∞r(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定比較困難，所以，將提取的PCR檢測(cè)具有目的條帶的農(nóng)桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，再提取大腸桿菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，如圖4所示，表明pCAMhp1033已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105。

2.3 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)對(duì)番茄子葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，最終得到抗性植株13株，番茄品種Micro-Tom的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程見(jiàn)圖5。

2.4 再生植株的PCR檢測(cè)

利用NptⅡ序列對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，以質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示?？剐灾仓暧?3株，8株表現(xiàn)為陽(yáng)性。這初步說(shuō)明1033CBF1目的基因整合到Micro-Tom的番茄基因組中。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的耐低溫性檢測(cè)

2.5.1 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)化植株的MDA和 O-2 · 含量的影響 在非低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株之間的MDA、

O2-含量無(wú)明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的MDA、 O-2 · 含量逐漸升高，而對(duì)照植株比轉(zhuǎn)基因植株升高趨勢(shì)快且顯著高于轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，由此可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜傷害程度比非轉(zhuǎn)基因植株輕（圖7-A、圖7-B）。

2.5.2 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)化植株的SOD和POD活性的影響 隨著5 ℃低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株的SOD活性在72 h時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)峰值，在0～72 h之間呈上升趨勢(shì)，之后下降。而POD活性均呈上升趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因株系 TS-1 和TS-2之間無(wú)明顯差異，且顯著高于對(duì)照植株（圖 7-C、圖7-D）。

2.5.3 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)化植株的脯氨酸（Pro）含量和CAT活性的影響 在非低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株之間的脯氨酸含量無(wú)明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時(shí)間的延

長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的脯氨酸含量均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，但明顯高于對(duì)照（圖 7-E）。由于研究表明脯氨酸含量與植物抗寒性有很大相關(guān)性，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性更強(qiáng)。隨著5 ℃低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因株系TS-1和TS-2的CAT活性呈上升趨勢(shì)，而對(duì)照植株則呈下降趨勢(shì)（圖7-F）。

2.5.4 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)化植株的ASA和PAL活性的影響 在非低溫脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株之間的ASA和PAL活性無(wú)明顯差異。隨著5 ℃低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的ASA、PAL活性逐漸下降，轉(zhuǎn)基因株系TS-1和TS-2之間差異不明顯，但明顯高于對(duì)照（圖7-G、圖7-H）。

2.5.5 轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)觀察 低溫脅迫后，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)未受影響，而非轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)受到一定抑制，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株高，葉色濃綠，而非轉(zhuǎn)基因植株的葉色要明顯比轉(zhuǎn)基因植株的淺，呈現(xiàn)淡綠色，且有一定程度的萎蔫（圖8）。

3 結(jié)論與討論

番茄是一種極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的世界性蔬菜作物[13]，而冷（凍）害常會(huì)嚴(yán)重影響其產(chǎn)量。低溫脅迫嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，番茄在溫度低于12 ℃時(shí)就不能正常開花結(jié)果和生長(zhǎng)發(fā)育[14]，在0～12 ℃之間，植株表現(xiàn)出冷害，損傷程度受到低溫脅迫時(shí)間的影響。多毛番茄是一種野生番茄，具有耐低溫甚至抗凍的特性。本研究成功構(gòu)建了多毛番茄的冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了番茄的轉(zhuǎn)ShCBF1植株，豐富了抗寒番茄轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)。

ROS（ O-2 · 、H2O2、·OH）是植物體有氧代謝不可避免的產(chǎn)物，會(huì)引發(fā)生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，并由此產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物，在低溫脅迫時(shí)，植物體自由基增加，使質(zhì)膜過(guò)氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致膜的損傷和破壞。本研究中轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)冷誘導(dǎo)處理后，丙二醛（MDA）含量和超氧自由基（ O-2 · ）含量均低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨C明了轉(zhuǎn)ShCBF1基因植株對(duì)低溫脅迫的耐受性增強(qiáng)，增加了自身的抗寒性。

低溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系中超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、脯氨酸（Pro）含量、過(guò)氧化氫酶

（CAT）活性、 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA）活性和苯丙氨酸解

氨酶（PAL）活性則高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡OD主要的功能是清除 O-2 · ，產(chǎn)生H2O2[15-17]。而CAT能夠在低溫脅迫過(guò)程中清除SOD產(chǎn)生的H2O2[18]，維持體內(nèi)活性氧代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗低溫脅迫。低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)誘導(dǎo)POD酶活性的增強(qiáng)，從而抵御低溫下氧自由基的傷害。適當(dāng)?shù)木S持體內(nèi)膜保護(hù)酶活性和 O-2 · 含量的平衡關(guān)系。由于冷誘導(dǎo)基因CBF1主要受冷誘導(dǎo)表達(dá)，因此，在冷脅迫下植株內(nèi)SOD活性增減可能是CBF1基因在低溫逆境誘導(dǎo)下超量表達(dá)，在一定程度上使得其自身有效清除體內(nèi)超氧離子的能力增強(qiáng)。

此外，在低溫脅迫條件下，自由基的不斷積累會(huì)破壞ASA和PAL對(duì)活性氧的毒害防御作用。而轉(zhuǎn)基因植株可能其本身耐冷基因CBF1受冷誘導(dǎo)后超量表達(dá)，增強(qiáng)了其耐冷機(jī)能。使轉(zhuǎn)基因植株的ASA和PAL活性顯著高于對(duì)照植株。冷脅迫后生理生化指標(biāo)的測(cè)定和植株形態(tài)觀察充分表明了轉(zhuǎn)ShCBF1基因可以提高番茄的抗冷性。

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