徐衛(wèi)華，高勝東

孝昌縣第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(湖北 孝昌 432900)

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缺氧誘導(dǎo)因子1α調(diào)控claudin-1蛋白表達(dá)對(duì)腸道粘膜屏障功能的影響

徐衛(wèi)華，高勝東

孝昌縣第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(湖北 孝昌 432900)

目的觀察缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)對(duì)緊密連接蛋白claudin-1及腸道屏障功能的影響。方法在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)大鼠小腸上皮細(xì)胞系IEC-6細(xì)胞，Elisa法檢測(cè)HIF1α的分泌，RT-PCR及免疫印跡法觀察claudin mRNA和蛋白表達(dá)，腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻檢測(cè)通透性。結(jié)果與常氧組比較，缺氧可明顯增加HIF1α分泌，減少claudin-1蛋白表達(dá)，減小跨上皮電阻(P<0.01；P<0.001)。以重組HIF1α處理常氧狀態(tài)下IEC-6細(xì)胞24～72 h，可明顯抑制claudin-1的mRNA表達(dá)(P<0.01；P<0.001)。結(jié)論缺氧狀態(tài)下IEC-6細(xì)胞分泌HIF1α增多，抑制claudin-1表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致屏障功能受損。

缺氧誘導(dǎo)因子1α；Claudin-1；缺氧；腸道屏障功能

【Abstract】Objective To observe the effects of Human hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) on claudin-1 expression and intestinal epithelial barrier function.Methods Intestinal epithelial cell line IEC-6 was cultured under the condition of normal oxygen and hypoxia. HIF1α secretion from IEC-6 was measured by Elisa and the expression of claudin-1 mRNA and protein was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot,respectively.Transepithelial electrical resistance was measured by resistance test instrument.Results Compared with the normoxia group,HIF1α secretion significantly increased in the hypoxia group and suppressed claudin-1 protein expression.Moreover,transepithelial electrical resistance was also reduced under hypoxia.IEC-6 cells under normoxia condition with recombinant HIF1α suppressed claudin-1 mRNA expression.Conclusions Under the hypoxia condition, HIF1α was increasingly secreted from IEC-6 cells and it suppressed claudin-1 expression,which in turn enhanced intestinal permeability and resulted in intestinal epithelial barrier dysfunction.

【Key words】Human hypoxia-inducible factor 1α;Claudin-1;hypoxia；intestinal epithelial barrier function

腸黏膜機(jī)械屏障主要由緊密連接(tight junction，TJ)這一結(jié)構(gòu)組成，為選擇性屏障，可阻止大多數(shù)親水性溶質(zhì)透過(guò)[1]。TJ主要由相關(guān)蛋白復(fù)合物組成，成員包括claudin、 occludin家族、ZO(zonula occludens)家族、連接黏附分子等，其中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白為claudin-1[2]。大量研究表明，腸黏膜屏障功能調(diào)控與局部缺氧關(guān)系密切。缺氧可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)穩(wěn)定表達(dá)[3]。然而HIF1α是否參與調(diào)控claudin-1表達(dá)，進(jìn)而影響腸黏膜屏障功能尚不清楚。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察HIF1α在缺氧條件下對(duì)claudin-1表達(dá)以及腸上皮屏障功能的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器大鼠小腸上皮細(xì)胞系 IEC-6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；HIF1α購(gòu)自艾美捷科技有限公司；HIF1α ELISA試劑盒購(gòu)自R&D Systems中國(guó)分公司；胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；抗大鼠閉合蛋白(claudin-1)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Transwell小室、Millicell ERS-2電阻測(cè)定儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、PVDF膜均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；電泳儀、垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó) BioRad公司；Trizol，RT-PCR引物及RT-PCR相關(guān)試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2IEC-6的培養(yǎng)與分組IEC-6細(xì)胞在 37℃、5% CO2飽和濕度的條件下用含10% 胎牛血清及100 U/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至90%以上融合后分為常氧組(21%氧濃度)培養(yǎng)24 h、缺氧組(2%氧濃度)培養(yǎng)4 h后，改用常氧繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.3Elisa法檢測(cè)HIF 1α采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度值。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.4RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)IEC-6細(xì)胞以 6×105密度每孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至90%以上融合后施加HIF1α處理24 h。之后以預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞，每孔加入1 mL Trizol，按說(shuō)明書步驟提取總RNA并定量后，取1 μg按照 Primescript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 (20 μL體系)，合成cDNA。RT-PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 45 s，55～58℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)， 最后72℃延伸10 min。取8 mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，以凝膠圖像分析儀(Bio-Rad公司)Imaging軟件分析 Claudin-1的灰度值，數(shù)據(jù)以檢測(cè)基因與內(nèi)參照 β-肌動(dòng)蛋白灰度值比值表示。Claudin-1引物序列：上游5’-CCTGCCCCAATGGAAGATTT-3’，下游5’-CCGATGACAGCCATCCACAT-3’。β-肌動(dòng)蛋白引物序列：上游5’-ACGGTCAGGTCATCACTACG-3’，下游5’-GGCATAGAGGT CTTTACGG ATG-3’。

1.5免疫印跡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞處理后，加入蛋白裂解液收集蛋白后BCA法進(jìn)行蛋白定量，按每孔蛋白上樣量為30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳。之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%小牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉30 min后，分別與抗claudin-1單克隆抗體，抗β-actin單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后與二抗(HRP標(biāo)記的鼠抗)室溫孵育1 h，之后加入ECL試劑顯影，采用凝膠圖像分析儀(Bio-Rad公司)拍照，并對(duì)條帶感光密度進(jìn)行定量分析。

1.6腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance，TER)檢測(cè)IEC-6細(xì)胞以 5×105密度每孔接種于24孔板的Transwell小室內(nèi)，24 h更換培養(yǎng)基，并用電阻測(cè)定儀測(cè)定TER，待期數(shù)值穩(wěn)定后進(jìn)行缺氧處理，之后檢測(cè)處理TER值，以原始數(shù)值減去空白對(duì)照 (小室內(nèi)未接種細(xì)胞)數(shù)值表示。

2　結(jié)果

2.1缺氧導(dǎo)致HIF 1α表達(dá)增加、claudin-1表達(dá)降低與常氧組比較，缺氧4 h后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24 h、48 h、72 h，ELISA結(jié)果顯示HIF 1α表達(dá)增多，最高峰為48 h，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；P<0.001)，見(jiàn)表1。與常氧組比較，缺氧4 h后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24 h、48 h、72 h，免疫印跡結(jié)果顯示claudin-1顯著下降，以缺氧后48 h表達(dá)量最低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；P<0.001)，見(jiàn)圖1。

表1　缺氧對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間IEC-6 HIF 1α

注：與常氧組比較，*P<0.01；**P<0.001。

圖1　免疫印跡法檢測(cè)常氧組(對(duì)照)、缺氧后不同時(shí)間Claudin-1蛋白表達(dá)　　A. 免疫印跡蛋白條帶。CON：常氧組；1：缺氧4 h后培養(yǎng)24 h組；2：缺氧4 h后培養(yǎng)48 h組；3：缺氧4 h后培養(yǎng)72 h組。B.灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。n=3，與對(duì)照組比較，*P<0.01；**P<0.001。

2.2缺氧降低TER與常氧組比較缺氧4 h后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24 h、48 h、72 h，TER明顯降低，以48 h降低為最大幅度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2缺氧對(duì)IEC-6 TER的影響

組別培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h培養(yǎng)72h常氧組126.6±10.8134.5±11.6140.8±11.5缺氧組90.4±8.6*71.5±8.2**88.6±10.3*

注：與常氧組比較，*P<0.01；**P<0.001。

2.3降低IEC-6細(xì)胞claudin-1 mRNA表達(dá)在常氧狀態(tài)下，以重組HIF 1α蛋白(10 ng/mL)處理IEC-6細(xì)胞 24～72 h后，可見(jiàn)claudin-1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，呈時(shí)間依賴性(P<0.01；P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2　RT-PCR檢測(cè)常氧條件下HIF 1α組處理IEC-6細(xì)胞24～72 h后Claudin-1 mRNA表達(dá) CON：對(duì)照組，未加HIF 1α處理；1：HIF 1α處理24 h組；2：HIF 1α處理48 h組；3：HIF 1α處理72 h組。n=3，與對(duì)照組比較，*P<0.01；**P<0.001。

3　討論

正常的腸道屏障功能可阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素等抗原侵入機(jī)體，具有重要的防御作用。在各種內(nèi)外病理性因素如應(yīng)激、感染等刺激之下，腸上皮屏障功能受損，通透性增加，腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素等可進(jìn)入全身血循環(huán)，嚴(yán)重者可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙等[4-5]。腸道屏障可分為機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學(xué)屏障，其中以機(jī)械屏障最為重要。近年來(lái)的研究表明，多種內(nèi)外病理性因素刺激可導(dǎo)致腸道局部微環(huán)境缺氧，導(dǎo)致腸道的機(jī)械屏障功能受損，但其機(jī)制并不十分清楚[6]。本組結(jié)果表明，缺氧可誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞表達(dá)HIF1α表達(dá)增多，后者可抑制TJ關(guān)鍵性的結(jié)構(gòu)蛋白claudin-1的表達(dá)，進(jìn)而影響腸道機(jī)械屏障功能。

在缺氧條件下，細(xì)胞最重要的應(yīng)答反應(yīng)之一即為HIF1α的誘導(dǎo)性表達(dá)上調(diào)。HIF1α普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，在常氧狀態(tài)下(21%O2)有低度表達(dá)，但其在缺氧條件下才可穩(wěn)定表達(dá)[7]。HIF1α蛋白N末端和C末端均存在反式激活結(jié)構(gòu)域(transactivationdomain,TAD)，即TAD-C和TAD-N，其中TAD-C發(fā)揮精細(xì)調(diào)整作用，TAD-N為激活轉(zhuǎn)錄所必需。作為參與缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)增加的HIF1α蛋白轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與HIF1β形成異源二聚體復(fù)合物，后者識(shí)別并與靶基因調(diào)控序列的缺氧反應(yīng)元件(hypoxiaresponseelement，HRE)相結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)[8]。本研究結(jié)果顯示，claudin-1 表達(dá)受到HIF1α蛋白調(diào)控，說(shuō)明claudin-1基因?yàn)镠IF1α的靶基因?；騿?dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，claudin-1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)HRE序列，這可能是HIF1α發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。后續(xù)我們將進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫沉淀的方法，對(duì)二者之間的結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)。

TJ的分子成分包括細(xì)胞之間內(nèi)在的跨膜蛋白、連接粘附分子和若干胞質(zhì)附著蛋白，其中claudin是TJ最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]。claudins屬于跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)其有24個(gè)家族成員，其中claudin-1是組成TJ的必要組成部分，其蛋白羧基端和氨基端都在胞質(zhì)與構(gòu)成細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白相連。多種疾病與claudin-1 蛋白表達(dá)或突變有關(guān)。例如慢性酗酒患者腸屏障性結(jié)構(gòu)受損，這與claudin-1表達(dá)降低有關(guān)[10]；claudin-1蛋白基因缺乏與致死性皮膚滲透性缺陷病密切相關(guān)等[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，claudin-1表達(dá)降低的同時(shí)，腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻明顯降低，說(shuō)明腸上皮黏膜屏障功能受損。他人的工作也表明：以特異性抑制劑環(huán)巴胺阻止claudin-1蛋白表達(dá)下調(diào)后，可改善缺氧導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷。

綜上所述，缺氧狀態(tài)下IEC-6細(xì)胞分泌HIF1α增多，可抑制claudin-1表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致屏障功能受損。進(jìn)一步對(duì)claudin在TJ中的結(jié)合方式、調(diào)節(jié)過(guò)程等方面開(kāi)展研究，將為缺氧所致的腸上皮黏膜屏障功能受損提供新的防治靶點(diǎn)。

[1]PijlsKE,JonkersDM,ElaminEE,etal.Intestinalepithelialbarrierfunctioninlivercirrhosis:anextensivereviewoftheliterature[J].LiverInt,2013,33(10):1 457-1 469.

[2]BarmeyerC,SchulzkeJD,FrommM.Claudin-relatedintestinaldiseases[J].SeminCellDevBiol,2015(42):30-38.

[3]ZhengL,KellyCJ,ColganSP.Physiologichypoxiaandoxygenhomeostasisinthehealthyintestine.AReviewintheTheme:CellularResponsestoHypoxia.AmJPhysiolCellPhysiol,2015,309(6):350-360.

[4]譚小宇,張晟晃,陳念平.ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)梗阻性黃疸腸道屏障保護(hù)作用的研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,24(4):24-26.

[5]MárquezM,FernándezGutiérrezdellamoC,Girón-GonzálezJA.Gutepithelialbarrierdysfunctioninhumanimmunodeficiencyvirus-hepatitisCviruscoinfectedpatients:Influenceoninnateandacquiredimmunity[J].WorldJGastroenterol,2016,22(4):1 433-1 448.

[6]LeiQ,QiangF,ChaoD,etal.AmeliorationofhypoxiaandLPS-inducedintestinalepithelialbarrierdysfunctionbyemodinthroughthesuppressionoftheNF-κBandHIF-1αsignalingpathways[J].IntJMolMed,2014,34(6):1 629-1 639.

[7]ScholzCC,TaylorCT.TargetingtheHIFpathwayininflammationandimmunity[J].CurrOpinPharmacol,2013,13(4):646-653.

[8]NguyenMP,LeeS,LeeYM.Epigeneticregulationofhypoxiainduciblefactorindiseasesandtherapeutics[J].ArchPharmRes,2013,36(3):252-263.

[9]KwonMJ.Emergingrolesofclaudinsinhumancancer[J].IntJMolSci,2013,14(9):18 148-18 180.

[10]WangY,TongJ,ChangB,etal.Effectsofalcoholonintestinalepithelialbarrierpermeabilityandexpressionoftightjunction-associatedproteins[J].MolMedRep,2014,9(6):2 352-2 356.

[11]WatoK,HaraT,YamanaK,etal.Aninsightintotheroleofbarrierrelatedskinproteins[J].IntJPharm,2012,427(2):293-298.

責(zé)任編輯：牟冬生

Human Hypoxia-Inducible Factor 1α Suppresses Claudin-1 Expression and Impairs Intestinal Epithelial Barrier Function

Xu Weihua,Gao Shengdong

(Department of Digestion in the First People′s Hospital of Xiaochang,Xiaochang 432900,China)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302112)。

徐衛(wèi)華(1968- )，男，湖北孝昌人，副主任醫(yī)師，研究方向：炎癥性腸病。

R363

A

1008-8164(2016)02-0006-04

2016-03-05