王　紅，張斯亮，關(guān)海霞中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科、內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110001

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胰高糖素樣肽-1受體激動劑對人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞生長和能量代謝的影響

王紅，張斯亮，關(guān)海霞
中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科、內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110001

［摘要］背景與目的：胰高糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）受體激動劑是一種新型降糖藥。在研發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)其可增加嚙齒類動物患甲狀腺C細(xì)胞腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。因此，該藥物對人類甲狀腺的影響引人關(guān)注。本研究旨在探討GLP-1受體激動劑對人甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）細(xì)胞增殖、降鈣素的分泌和能量代謝的影響。方法：體外培養(yǎng)人MTC細(xì)胞系（TT）。分別以0、1、10和100 nmol/L艾塞那肽和利拉魯肽處理細(xì)胞24、48和72 h后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測GLP-1受體激動劑艾塞那肽和利拉魯肽處理后細(xì)胞增殖情況；采用降鈣素試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中降鈣素水平的變化；采用Seahorse能量代謝分析儀檢測細(xì)胞糖酵解及線粒體呼吸的變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），降鈣素的量與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同濃度艾塞那肽和利拉魯肽處理細(xì)胞24 h后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細(xì)胞能量代謝并無明顯影響（P＞0.05），隨著艾塞那肽和利拉魯肽處理時(shí)間延長，TT細(xì)胞糖酵解和線粒體呼吸并無明顯改變（P＞0.05）。結(jié)論：GLP-1受體激動劑對人MTC發(fā)生、發(fā)展無明顯促進(jìn)作用，未來仍需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)GLP-1受體激動劑的安全性。

［關(guān)鍵詞］甲狀腺髓樣癌；艾塞那肽；利拉魯肽；能量代謝

甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）占所有甲狀腺癌的5%～10%。與其他類型的甲狀腺癌相比，MTC在臨床癥狀、診斷及治療方面的特征均不相同。MTC起源于甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞，過度分泌降鈣素，且惡性程度高、預(yù)后差，嚴(yán)重威脅患者的生存質(zhì)量和壽命［1］。新一類降糖藥物胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑利拉魯肽在研發(fā)過程中，曾發(fā)現(xiàn)其可激活嚙齒類動物甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞的GLP-1受體，引起C細(xì)胞異常增生，有潛在的致MTC的風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。但目前為止，GLP-1受體激動劑是否會促進(jìn)人MTC生長和增殖尚未明確。本研究觀察GLP-1受體激動劑對MTC細(xì)胞增殖和降鈣素的分泌的作用，并從能量代謝角度探討GLP-1受體激動劑對MTC細(xì)胞的影響。

1　.1 材料和方法

1.1材料

人MTC細(xì)胞系TT購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基F12、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素和鏈霉素均購自美國Hyclone公司。艾塞那肽購自美國禮來公司，利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁公司。降鈣素測定試劑盒購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。XF糖酵解壓力測試試劑盒、XF細(xì)胞線粒體壓力測試試劑盒和XF基礎(chǔ)培養(yǎng)液均購自美國Seahorse Bioscience公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

TT細(xì)胞培養(yǎng)于F12培養(yǎng)基，其中青霉素終濃度為100 U/mL，鏈霉素終質(zhì)量濃度為100 mg/ L，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞生長和增殖

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化，在培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種于96孔板，每孔200 μL。貼壁24 h后用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每孔加10 μL CCK-8，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各個(gè)孔的吸光度（D）值。最后計(jì)算不同濃度和作用時(shí)間下細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值）/（對照組D值-空白組D值）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3降鈣素實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞降鈣素

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化，將細(xì)胞以1×104/mL接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收取細(xì)胞培養(yǎng)基，應(yīng)用降鈣素試劑盒測定降鈣素水平。

1.2.4Seahorse能量代謝分析儀檢測細(xì)胞能量代謝的改變

將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，用含不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽的培養(yǎng)基制成密度為1.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔80 μL接種于Seahorse專用96孔板（12 000個(gè)細(xì)胞/孔）。處理24 h組，室溫靜置1 h，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)23 h；處理時(shí)間為48 h組，細(xì)胞先種入6孔板，培養(yǎng)24 h后胰酶消化，再種入Seahorse專用96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)水化探針板過夜。糖酵解壓力測試試驗(yàn)：分別向探針板A、B和C孔加入葡萄糖、寡霉素和2-脫氧葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）；線粒體壓力測試試驗(yàn)：分別向探針板A、B和C孔加入寡霉素、羰基-氰-對-三氟甲氧基苯腙（carbonyl cyanide p-trifuormethoxyphenylhydrazo ne，F(xiàn)CCP）、抗霉素和魚藤酮。校正探針板后，加入細(xì)胞培養(yǎng)板檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié) 果

2.1GLP-1受體激動劑對TT細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細(xì)胞后的增殖情況，結(jié)果顯示，與對照組相比較，不同濃度的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT 24、48 和72 h后，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞相對數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著處理時(shí)間延長，仍未見實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞相對數(shù)出現(xiàn)明顯變化（P＞0.05，圖1）。

2.2GLP-1受體激動劑對TT細(xì)胞分泌降鈣素的影響

測定不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細(xì)胞后培養(yǎng)基中降鈣素水平的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著艾塞那肽和利拉魯肽處理濃度增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞降鈣素分泌水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且隨著處理時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞降鈣素濃度與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

2.3GLP-1受體激動劑對TT細(xì)胞糖酵解和線粒體呼吸的影響

采用Seahorse能量代謝分析儀檢測不同濃度（0、1、10和100 nmol/L）的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT后細(xì)胞糖酵解和線粒體呼吸水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度的艾塞那肽和利拉魯肽處理TT細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞糖酵解和線粒體呼吸水平未見明顯改變；隨著處理時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對照組相比，糖酵解和線粒體呼吸水平仍無明顯變化（圖3）。

圖1　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細(xì)胞生長和增殖的影響Fig.1 Efects of exenatide and liraglutide on cell proliferation in TT cells

圖2　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細(xì)胞降鈣素分泌的影響Fig.2 Efects of exenatide and liraglutide on the secretion of calcitonin in TT cells

圖3　艾塞那肽和利拉魯肽對TT細(xì)胞能量代謝影響Fig.3 Efects of exenatide and liraglutide on energy metabolism of TT cells

3　討 論

GLP-1受體激動劑可以在體內(nèi)模擬GLP-1的作用，與GLP-1受體結(jié)合，激活胰島素信號通路促進(jìn)胰島素合成并有助于胰島細(xì)胞的修復(fù)和再生，是治療2型糖尿病的新型降糖藥之一。但在該類藥物研發(fā)的過程中，曾發(fā)現(xiàn)在嚙齒類動物中，利拉魯肽有潛在致MTC的風(fēng)險(xiǎn)，艾塞那肽可增加甲狀腺C細(xì)胞腺瘤的風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。因此，GLP-1受體激動劑對人類甲狀腺癌是否存在影響受到了極大的關(guān)注。我們的前期體外研究顯示，人類甲狀腺乳頭狀癌中存在GLP-1受體表達(dá)，但艾塞那肽和利拉魯肽沒有促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖［4］。在Gier等［5］的研究中發(fā)現(xiàn)，與嚙齒類動物甲狀腺C細(xì)胞具有豐富GLP-1受體表達(dá)不同，人類MTC細(xì)胞系中雖有GLP-1受體的表達(dá)，但其表達(dá)量低。GLP-1受體激動劑臨床上市后，目前尚沒有發(fā)布艾塞那肽和利拉魯肽治療會增加人類患MTC的警示［6］。盡管如此，在完全確認(rèn)GLP-1受體激動劑的甲狀腺安全性之前，還需要更多的體外、體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，本研究利用人類MTC細(xì)胞系，探討GLP-1受體激動劑對嚙齒類動物甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的負(fù)面作用是否也存在于人類MTC細(xì)胞上。

對于利拉魯肽和艾塞那肽對MTC細(xì)胞的影響，首先從細(xì)胞增殖和降鈣素分泌角度進(jìn)行了探討。細(xì)胞增殖是經(jīng)典的反映腫瘤細(xì)胞生長的指標(biāo)。降鈣素由濾泡旁C細(xì)胞分泌，是MTC的特異性腫瘤標(biāo)志物。已有研究明確血清降鈣素篩查可作為甲狀腺結(jié)節(jié)患者術(shù)前診斷MTC的敏感指標(biāo)［7-8］。Trimboli等［9］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，與甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查相比，通過測定細(xì)針穿刺針洗脫液中的降鈣素水平診斷MTC的靈敏度更高。此外，MTC患者聯(lián)合檢測血清降鈣素和癌胚抗原可以提高診斷的敏感性，有助于MTC的早期診斷和治療，并且術(shù)后動態(tài)觀察血清降鈣素和癌胚抗原，對于判斷手術(shù)效果和腫瘤復(fù)發(fā)有重要意義［10］。美國甲狀腺學(xué)會的指南也建議MTC術(shù)后患者隨訪期間行血清降鈣素檢測以預(yù)測復(fù)發(fā)，并可依據(jù)降鈣素水平?jīng)Q定進(jìn)一步治療策略［1］。可見，降鈣素是評估MTC發(fā)生、發(fā)展的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細(xì)胞的生長沒有促進(jìn)作用，并且兩種藥物對MTC細(xì)胞降鈣素的分泌沒有影響。

本研究進(jìn)一步應(yīng)用Seahorse能量代謝分析儀分析了艾塞那肽和利拉魯肽對MTC細(xì)胞能量代謝的影響。之所以選擇能量代謝作為研究內(nèi)容，是因?yàn)閻盒阅[瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特性之一是細(xì)胞代謝的改變，以“瓦博格效應(yīng)”為突出代表，即腫瘤細(xì)胞即使在供氧充足條件下也會以糖酵解為主要供能方式，并出現(xiàn)線粒體呼吸功能降低。鑒于越來越多證據(jù)表明這種能量代謝改變是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)［11-12］，因此以該指標(biāo)作為評估GLP-1受體激動劑是否可以促進(jìn)MTC進(jìn)展的佐證。研究結(jié)果并未提示艾塞那肽和利拉魯肽可以改變MTC細(xì)胞能量代謝模式，這進(jìn)一步支持了兩種藥物對人類MTC細(xì)胞無影響。

綜上所述，本研究從細(xì)胞增殖、降鈣素分泌和能量代謝角度提示GLP-1受體激動劑不會促進(jìn)MTC發(fā)生、發(fā)展。但本研究僅在體外實(shí)驗(yàn)層面上對利拉魯肽和艾塞那肽進(jìn)行了安全性的初步研究。作為2型糖尿病患者新型降糖藥物，未來仍需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)GLP-1受體激動劑在實(shí)際應(yīng)用中的安全性。

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DOI：10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.06.002

中圖分類號：R736.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）06-0487-05

收稿日期：（2015-12-01 修回日期：2016-05-10）

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2013225021）。通信作者：關(guān)海霞 E-mail： hxguan@vip.126.com

Effect of glucagon-like peptide-1 receptor agonists on growth and energy metabolism in human medullary thyroid cancer cells

WANG Hong， ZHANG Siliang， GUAN Haixia
（Department of Endocrinology and Metabolism， the Endocrine Institute， the First Hospital of China Medical University， the Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases， Shenyang 110001， Liaoning Province， China）Correspondence to： GUAN Haixia E-mail： hxguan@vip.126.com

［Abstract］Background and purpose： This study aimed to investigate the efect of glucagon-like peptide-1 receptor agonists on proliferation， secretion of calcitonin and energy metabolism of medullary thyroid cancer （MTC）cell. Methods： The MTC cell line （TT） was cultured in vitro. After treatment with exenatide and liraglutide （0， 1， 10 and 100 nmol/L） for 24， 48 and 72 h， the proliferation of TT was analyzed by CCK-8 kit， the calcitonin was measured by calcitonin assay kits， and the energy metabolism of TT was measured by Seahorse XF instrument. Results： When compared with control group， neither exenatide nor liraglutide had efects on proliferation of TT （P＞0.05）； the calcitonin levels did not change signifcantly after treatment with GLP-1 receptor agonists （P＞0.05）. Exenatide and liraglutide did not alter glycolysis and mitochondrial respiration in TT cells in a dose- and time-dependent manner. Conclusion：GLP-1 receptor agonists have no efect on the development of TT. Further collection of the safety data of exenatide and liraglutide on thyroid is still needed.

［Key words］Medullary thyroid cancer； Exenatide； Liraglutide； Energy metabolism