賈思思，南飛飛，李素彩，曹婧語，王冠男，張明智，張 蕾1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省淋巴瘤診療中心，河南 鄭州 450052；.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052

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EB病毒編碼的小mRNA陰性結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤的臨床特征及預(yù)后分析

賈思思1,2，南飛飛1,2，李素彩1,2，曹婧語1,2，王冠男3，張明智1,2，張 蕾1,2
1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省淋巴瘤診療中心，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052

［摘要］背景與目的：結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤（extranodal natural killer/T-cell lymphoma，ENKTL）為非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)亞型，中國發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家。該病惡性程度高，對(duì)化療不敏感，生存期短，預(yù)后差，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與該病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，但仍有少數(shù)患者無EBV感染。本研究探討EBV編碼的小mRNA（EBV-encoded small RNA，EBER）原位雜交陰性患者的臨床特征及預(yù)后相關(guān)因素。方法：選取2011年8月—2015年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科診斷為ENKTL的326例標(biāo)本，采用原位雜交技術(shù)檢測其EBER表達(dá)，回顧性分析8例EBER陰性患者臨床特征及預(yù)后相關(guān)因素。結(jié)果：326例ENKTL中，EBER表達(dá)陰性率為2.45%（8/326），8例EBER表達(dá)陰性患者的中位生存期為17個(gè)月。EBER陰性與EBER陽性患者的生存率log-rank檢驗(yàn)，兩條生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.407，P=0.011）。多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與EBER陰性ENKTL患者預(yù)后有關(guān)（P=0.008），血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)與EBER陰性患者的預(yù)后無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論：EBER表達(dá)陰性ENKTL發(fā)病率低，預(yù)后較EBER陽性患者差，LDH升高可能是其預(yù)后不良因素。

［關(guān)鍵詞］結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤；EB病毒編碼的小mRNA陰性；臨床特征；預(yù)后

結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤（extranodal natural killer/T-cell lymphoma，ENKTL）為非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）的一個(gè)亞型，其發(fā)病率占NHL的5%～18%［1］，居T細(xì)胞淋巴瘤的首位，中國發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家，主要發(fā)生在鼻腔及鼻側(cè)的區(qū)域，是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為的腫瘤。該病呈高度侵襲性進(jìn)展，對(duì)化療不敏感，生存期短，預(yù)后差。Suzuki［2］報(bào)道，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）存在于幾乎所有ENKTL的腫瘤細(xì)胞中，通?？捎迷浑s交技術(shù)在腫瘤細(xì)胞中檢測到EBV編碼的小mRNA（EBV-encoded small RNA，EBER），但仍有極少數(shù)患者EBER表達(dá)陰性。關(guān)于這部分患者的臨床特征及預(yù)后因素目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用原位雜交技術(shù)檢測326例ENKTL患者標(biāo)本中EBER表達(dá)情況，回顧性研究8例EBER陰性患者血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)及臨床特征，分析其與預(yù)后的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1材料

1.1.1一般材料

收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2011年8月—2015年10月經(jīng)HE染色和免疫組織化學(xué)確診的ENKTL病例326例，經(jīng)兩位資深淋巴瘤病理醫(yī)師進(jìn)行重新閱片，均符合2008年WHO淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［3］，用原位雜交技術(shù)篩選出8例EBER表達(dá)陰性病例。

1.1.2試劑與儀器

ISH-6021 EBER原位雜交檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052BS-m）購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，組織芯片機(jī)購自美國Beecher公司，TheraioBrite原位雜交儀購自美國StatSpin公司，石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司，OLYMPUS BX51高級(jí)熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1EBER原位雜交檢測方法

將常規(guī)石蠟包埋的ENKTL病例的石蠟組織制成4 μm石蠟切片，經(jīng)56～60 ℃烤片2～16 h。具體操作方法參照EBER原位雜交試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2EBER原位雜交結(jié)果判定

以已知陽性的鼻咽癌組織為陽性對(duì)照，PBS緩沖液代替雜交液或一抗為陰性對(duì)照。EBER陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)不著色；反之為陰性。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)［4］：中倍視野（×20）觀察陽性細(xì)胞數(shù)，分4個(gè)等級(jí)：0級(jí)（0～1個(gè)細(xì)胞）；1級(jí)（1～10個(gè)細(xì)細(xì)胞）；2級(jí)（10～100個(gè)細(xì)胞）；3級(jí)（＞100個(gè)細(xì)胞）。

1.2.3ENKTL患者的觀察指標(biāo)及隨訪

觀察指標(biāo)包括EBER陰性及EBER陽性的ENKTL病例的年齡、性別、原發(fā)部位、分期、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、是否合并B癥狀、預(yù)后指數(shù)、治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)和治療方案。以電話形式進(jìn)行隨訪，起始時(shí)間為病理確診時(shí)間，隨訪截止2015年12月1日，隨訪時(shí)間為1.5～48.0個(gè)月。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。生存資料中，EBER陰性及EBER陽性患者的生存分析用Kaplan-Meier生存分析法，兩組患者的生存率比較用log-rank檢驗(yàn)。多因素生存分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1ENKTL中EBER表達(dá)陰性率

在326例ENKTL病例中，EBER表達(dá)陰性8例，EBER表達(dá)陽性318例，EBV陰性率為2.45%。

2.2EBER表達(dá)陰性患者的臨床特征

8例EBER表達(dá)陰性ENKTL患者中，男性6例，女性2例，男女比例為6∶2；年齡21～70歲，中位年齡（45.25±14.76）歲；7例發(fā)生于鼻腔，1例原發(fā)于食管。

所有患者均為Ⅰ～Ⅱ期；均無局部淋巴結(jié)腫大；其中3例伴發(fā)B癥狀；1例LDH升高；預(yù)后指數(shù)0分5例，1分2例，2分1例；共有3例患者治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)增高，分別為6.28× 102/mL、7.13×104/mL和5.23×104/mL（表1）。

2.3病理形態(tài)學(xué)

ENKTL的病理形態(tài)特征表現(xiàn)為非均質(zhì)性，細(xì)胞大小不等，形態(tài)為中小細(xì)胞混合，細(xì)胞核復(fù)雜或多態(tài)性［5］。特征性表現(xiàn)為血管中心性病變，腫瘤細(xì)胞侵犯小血管壁或血管周圍組織，導(dǎo)致組織缺血和廣泛壞死；混合性炎性細(xì)胞多，區(qū)域壞死常見。最典型的免疫表型為CD56陽性，同時(shí)CD2、胞質(zhì)CD3ε、CD8和CD45RO 等T細(xì)胞相關(guān)抗原常為陽性，但細(xì)胞膜CD3陰性，可見細(xì)胞毒性顆粒蛋白，如顆粒酶B、T細(xì)胞內(nèi)抗原和穿孔素等。

2.4生存分析

截至隨訪日期2015年12月1日，8例EBER陰性ENKTL患者中，存活3例，死亡5例。EBER陽性患者中，共53例檢測了治療前EBV-DNA拷貝數(shù)。

用Kaplan-Meier生存分析法分析61例ENKTL患者生存情況，得出其生存曲線，EBER陰性患者中位生存期為17個(gè)月，尚無法估計(jì)EBER陽性患者中位生存期（圖1）。兩組生存率log-rank檢驗(yàn)，兩條生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.407，P=0.011）。

運(yùn)用Cox模型生存分析法，以年齡、性別、原發(fā)部位、分期、LDH、B癥狀、預(yù)后指數(shù)、治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)和治療方案9個(gè)因素做多因素生存分析，得出其中僅LDH 與EBER陰性結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者死亡有關(guān)（P=0.008），而治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)等其他因素與EBER陰性患者的死亡均無關(guān)（P＞0.05，表2）。

表1　8例EBER表達(dá)陰性ENKTL患者臨床特征Tab.1 The clinical features of eight EBER negative ENKTL patients

圖1　EBER陰性及EBER陽性ENKTL患者PFS及OS曲線Fig.1 The PFS and OS curves of EBER-negative and EBER-positive ENKTL patients

表2　8例EBER陰性ENKTL患者Cox多變量回歸分析結(jié)果Tab.2 The results of Cox multivariate regression analysis of EBER-negative ENKTL

3　討 論

多項(xiàng)研究表明，ENKTL的發(fā)生、發(fā)展與EBV感染密切相關(guān)［6-8］。EBER是EBV的表達(dá)產(chǎn)物，在EBV感染的任何時(shí)期轉(zhuǎn)錄，包括潛伏期和病毒復(fù)制期，其表達(dá)量很高，最適于臨床診斷EBV感染［4］。外周血EBV-DNA拷貝數(shù)增高在疾病分期、B癥狀、客觀緩解率及無進(jìn)展生存期方面具有重要的臨床意義［9］，可作為治療后微小殘留病的一項(xiàng)指標(biāo)［10］。目前針對(duì)ENKTL的研究主要圍繞EBV感染，然而EBER表達(dá)陰性者的臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)因素尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究對(duì)確診為ENKTL的326例標(biāo)本重新檢測其EBER表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)僅有8例標(biāo)本EBER表達(dá)為陰性，其EBV感染率達(dá)97.55%，與Barrionuevo等［11］的報(bào)道類似。王小藝等［12］在對(duì)2008年1月—2012年4月診斷的淋巴瘤EBV感染狀態(tài)的一項(xiàng)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，36例ENKTL中有28例EBER表達(dá)陽性，其陽性率為84.8%。本研究結(jié)果高于王小藝等報(bào)道所占比例，可能與分子生物技術(shù)的進(jìn)步、EBER原位雜交技術(shù)的靈敏度增高有關(guān)。

回顧性分析該8例患者的臨床病理特征，并隨訪患者生存情況，發(fā)現(xiàn)男性患者多于女性，且好發(fā)于青年男性，原發(fā)部位多于鼻腔，這些與EBV感染者類似［1-2］。所有患者均為Ⅰ～Ⅱ期，其中3例治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)增高，1例LDH升高；8例患者中，7例均采用放療為主聯(lián)合化療的方法治療，1例單純應(yīng)用含吉西他濱方案化療；中位生存時(shí)間為17個(gè)月。本研究發(fā)現(xiàn)，EBER陰性ENKTL患者生存期較EBER陽性者短，預(yù)后差，可能與EBER陰性患者采用放療聯(lián)合CHOP類方案治療及EBER陰性病例數(shù)較少有關(guān)；年齡、性別、原發(fā)部位是否鼻腔、臨床分期、B癥狀、預(yù)后指數(shù)和治療前血漿EBV-DNA拷貝數(shù)均與生存時(shí)間無關(guān)，僅LDH升高是影響患者生存的獨(dú)立因素，這與大多數(shù)報(bào)道不一致?？赡苁荅BER表達(dá)陰性病例少見，仍需大樣本研究。

近年來，隨著含吉西他濱或左旋門冬酰胺酶方案的應(yīng)用，ENKTL的預(yù)后已有大幅度提升［13］，但EBV致病機(jī)制仍不明確，研究者致力于研究EBV免疫逃避的表觀遺傳學(xué)機(jī)制并治療EBV感染［7，14］，從而提高ENKTL乃至所有EBV相關(guān)疾病的療效及預(yù)后，然而在EBER不表達(dá)患者中，該種方案是否可行有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果初步表明，EBER表達(dá)陰性的ENKTL的臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)因素與EBER陽性的ENKTL截然不同，但EBER原位雜交在ENKTL的診斷、治療和預(yù)后方面仍有重要的提示作用。本研究病例數(shù)有限，仍需進(jìn)一步探索。

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DOI：10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.06.009

中圖分類號(hào)：R733.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639（2016）06-0533-05

收稿日期：（2015-12-18 修回日期：2016-03-22）

基金項(xiàng)目：河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（142300410389）。

通信作者：張 蕾 E-mail： zl2909@163.com

The clinical features and prognosis of EBER negative extranodal natural killer/T-cell lymphoma

JIA Sisi1，2， NAN Feifei1，2， LI Sucai1，2， CAO Jingyu1，2， WANG Guannan3， ZHANG Mingzhi1，2， ZHANG Lei1，2
（1.Department of Oncology， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052，Henan Province， China； 2.Lymphoma Diagnosis and Treatment Center of Henan Province， Zhengzhou 450052， Henan Province， China； 3.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， Henan Province， China）
Correspondence to： ZHANG Lei E-mail： zl2909@163.com

［Abstract］Background and purpose： Extranodal natural killer/T-cell lymphoma （ENKTL） is a form of non-Hodgkin's lymphoma. The ENKTL incidence in China is much higher than that in the Western countries. The disease is highly malignant， not sensitive to chemotherapy， has short survival period and poor prognosis. Epstein-Barr virus （EBV） infection has close relationship with the development of the disease. However， there are still a few patients without EBV infection. This study aimed to discuss the clinical features and prognosis of EBV-encoded small RNA （EBER） in situ hybridization negative ENKTL. Methods： From Aug. 2011 to Oct. 2015， 326 cases were diagnosed with ENKTL from the First Afliated Hospital of Zhengzhou University. The expression of EBER was detected by in situ hybridization technique. The clinical pathological characteristics and prognosis of EBER-negative patients were analyzed. Results： In 326 patients with ENKTL， the negative rate of EBER was 2.45% （8/326）. In 8 EBER-negative patients，the median survival time was 17 months. The log-rank test revealed that there was a signifcant diference between EBER-negative and EBER-positive curves （χ2=6.407， P=0.011）. Multivariate Cox proportional hazards regressionanalysis showed that in EBER-negative ENKTL， only lactate dehydrogenase （LDH） predicted survival time （P=0.008）. EBV-DNA copy number in plasma was not signifcantly correlated with survival time （P＞0.05）. Conclusion： The incidence of EBER-negative ENKTL is low. Patients with EBER-negative ENKTL have poorer prognosis than EBER-positive patients. Elevated LDH may be a factor indicating poor prognosis.

［Key words］Extranodal NK/T-cell lymphoma； EB virus-encoded small RNA negative； Clinical features； Prognosis