魏彥輝++周榮艷++張軍杰

摘要：為了研究c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中的表達與定位并探索c-KIT在毛色形成中的作用機制，以黑山羊、白山羊為研究對象，利用實時定量PCR技術(shù)分析其相對表達量，并采用免疫組織化學技術(shù)進行c-KIT表達定位分析。結(jié)果表明，在山羊皮膚組織中，c-KIT主要分布在皮膚上皮部、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部以及內(nèi)外根鞘。c-KIT在黑山羊、白山羊毛色皮膚組織中表達部位、表達水平無顯著差異，表明c-KIT的表達量、表達部位不是造成黑山羊、白山羊色差異的主要因素。

關(guān)鍵詞：c-KIT；山羊；免疫組織化學；皮膚；毛色

中圖分類號：S827.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0038-03

絨、毛及裘皮是山羊重要的經(jīng)濟性狀，毛色表型特征的選育尤其受到各國育種人員的關(guān)注[1]。探索山羊毛色形成的機制可以為培育天然的彩色山羊提供理論基礎(chǔ)。哺乳動物的毛色表型特征主要是由毛發(fā)中黑色素的類型、數(shù)量決定的。c-KIT 編碼的蛋白表達于黑素細胞前體物，肥大/干細胞生長因子的受體（mast/stem cell growth factor receptor，c-KIT）屬于跨膜酪氨酸激酶受體，參與黑素細胞形成、成熟、增殖、分化及遷移等過程[2-4]。經(jīng)過伊馬替尼處理的人表皮黑素細胞中，由于c-KIT不能被磷酸化，從而可以抑制黑素細胞的遷移[5]。張巧靈等通過免疫組化分析得到Kit蛋白，在白色羊駝皮膚毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘及其結(jié)締組織中有一定量的表達，但其在黃色羊駝表皮下層的結(jié)締組織中只有很少量的表達[6]。Kit在白色羊駝中顯著表達，其相對表達量是棕色羊駝的4.602 9倍[7]。但是關(guān)于c-KIT在山羊皮膚組織內(nèi)的表達及其是否與山羊毛色的形成有關(guān)未見報道。本試驗以黑色山羊、白色山羊為研究對象，首次對c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中的表達定位進行了研究，在轉(zhuǎn)錄水平對其在不同毛色山羊皮膚組織中的表達情況進行了檢測，探索該基因與山羊毛色形成的關(guān)系，旨在為研究c-KIT調(diào)控山羊毛色形成的分子機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

在河北省定州市隨機挑選成年白色山羊、黑色山羊各3只，選取體側(cè)部位皮膚，用刮毛器刮凈羊毛，用手術(shù)法取 1 cm2 左右皮膚組織6塊。將用于總RNA提取的3塊皮膚快速投入液氮中保存，將用于免疫組織化學分析研究的3塊皮膚投入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后制成組織切片。

1.2主要試劑和儀器

兔抗人c-KIT抗體（購自Santa Cruz Biotechnology INC公司）；封閉用山羊血清工作液、生物素標記的羊抗兔IgG、Streptavidin-HRP工作液、DAB顯色試劑盒（均購自康為世紀公司）；蘇木素（Solarbio公司）；RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；熒光定量試劑盒（日本東洋紡公司）；其他常規(guī)試劑均使用國產(chǎn)分析純試劑。PCR儀（德國Biometra公司）；iQ5實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）；核酸蛋白測定儀ND2000 （Thermo公司）；高速冷凍離心機（Sigma公司）。

1.3總RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄合成

取凍存的山羊皮膚組織，按照RNA提取試劑盒說明書進行總RNA提取，利用核酸蛋白測定儀進行濃度與純度測定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA第一鏈合成，配制模板RNA 10 μL、oligo（dT）18 5 μL、RNase free ddH2O 15 μL的混合液；70 ℃保溫 10 min，冰上急冷2 min。短暫離心后分別加入10 μL 5×M-MLV Buffer、2.5 μL 10 mmol/L dNTP Mixture、1.25 μL Recombinant Ribonuclease Inhibitor、1.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV和5 μL RNase free ddH2O。42 ℃保溫1 h，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4山羊皮膚組織中c-KIT的qRT-PCR

1.4.1反轉(zhuǎn)錄合成c-KIT的cDNA根據(jù)山羊c-KIT的基因序列以及GADPH的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物，由華大六合基因公司合成。引物序列如下：c-KIT基因正引物：5′-GGCCCACCCTGGTCATTACAGAATAT-3′，反引物：5′-TGTCTGCCGCCTTGGTTGGTAC-3′，預期擴增片段大小為225 bp；GADPH基因正引物：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，反引物：5′-CAGTGGTCATAAGTCCCTCC-3′，預期擴增片段大小為107 bp。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包含cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，2x Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預變性 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 10 min。擴增結(jié)束后用 1%瓊脂糖凝膠對產(chǎn)物進行電泳檢測和回收純化，連接pEASY-T3載體并轉(zhuǎn)化trans1-t1感受態(tài)細胞，選取陽性重組子后送北京中科希林生物科技有限責任公司測序，確定為陽性的克隆提取質(zhì)粒。

1.4.2測定c-KIT基因表達量取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，每個cDNA分別使用的引物對c-KIT與內(nèi)參GAPDH進行實時定量PCR擴增。優(yōu)化后的反應(yīng)體系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總計20 μL。擴增程序：95 ℃ 45 s；95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3次重復。反應(yīng)結(jié)束后以溶解曲線來判定反應(yīng)的特異性。

1.4.3數(shù)據(jù)分析利用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均用平均值±標準誤表示，其中基因的表達量結(jié)果經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH表達量校正。分別擴增SCF、GAPDH基因，通過2-ΔΔCT法計算SCF基因在不同毛色山羊皮膚組織中的相對表達水平，ΔCT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT黑色山羊-ΔCT白色山羊，SCF基因mRNA表達差別倍數(shù)以2-ΔΔCT表示。

1.5山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組化分析

將固定在10%甲醛溶液的皮膚組織取出，經(jīng)過脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，獲得厚度為5 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫甲醇溶液處理 20 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；用PBS清洗3次，每次 5 min。0.1%胰蛋白酶抗原修復；室溫下用山羊血清封閉 20 min，去掉封閉液，滴加一抗（1 ∶80稀釋），4 ℃孵育16 h，37 ℃復溫20 min，PBS代替一抗作為陰性對照；PBS清洗后滴加二抗（生物素標記的羊抗兔IgG），室溫孵育30 min；PBS清洗后加入Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育20 min；PBS清洗后滴加DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍攝。

2結(jié)果與分析

2.1山羊皮膚組織中總RNA的提取

將所提取的皮膚組織總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳條帶清晰，28 S、18 S清晰可見（圖1）。用核酸測定儀進行RNA樣品測定，D260 nm與D280 nm比值為1.8～2.0。

2.2山羊皮膚組織中c-KIT的qRT-PCR

2.2.1實時熒光定量試驗經(jīng)過PCR條件優(yōu)化，成功擴增了與預期大小一致的片段，電泳檢測顯示條帶清晰整齊，擴增結(jié)果良好。對鑒定為陽性的重組質(zhì)粒按10倍倍比稀釋，進行實時熒光定量PCR擴增，由圖2、圖3可以看出c-KIT、GADPH基因的擴增產(chǎn)物CT值均一，熔解曲線只有1個明顯的峰，表明在實時熒光定量PCR過程中，熒光信號均來自于特異性擴增產(chǎn)物，且沒有產(chǎn)生非特異性擴增及引物二聚體。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)自動生成起始模板濃度與CT值間的回歸曲線，該標準曲線檢測靈敏度為109～105個模板。c-KIT基因的回歸方程為y=40.108-3.275x，r2=0.992；GADPH基因的回歸方程為y=45.351-3.276x，r2 =0.998。由此可見，所建立的回歸方程可以用于實時熒光定量試驗。

2.2.2實時熒光定量結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT相對定量方法的結(jié)果，表明c-KIT基因在黑色山羊皮膚中的mRNA表達水平是白色山羊的1.28倍，且差異不顯著。

2.3山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組化結(jié)果

山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組織化學結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示，在白色山羊、黑色山羊皮膚組織中，c-KIT主要定位在細胞膜上，在皮膚上皮、毛囊漏斗部、外根鞘、內(nèi)根鞘、皮脂腺以及汗腺有陽性著色，對照組無著色。對不同毛色山羊皮膚組織中的陽性細胞平均光密度進行測定比較，結(jié)果表明，c-KIT 在白色山羊、黑色山羊皮膚組織中陽性細胞（毛囊漏斗部、外根鞘、內(nèi)根鞘）的表達量不存在顯著差異。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中主要分布于表皮、毛囊內(nèi)外根鞘、毛囊漏斗部、皮脂腺、汗腺中，并且黑色山羊、白色山羊皮膚組織中c-KIT的表達部位、表達量無顯著差異。c-KIT表達于黑素細胞前體物，作為肥大/干細胞生長因子受體（mast/stem cell growth factor receptor，c-KIT），屬于跨膜酪氨酸激酶受體，參與黑素細胞的形成、成熟、增殖、分化及遷移等過程[2-4]，在物種毛色形成中起重要作用。在正常人皮膚中，c-KIT表達于表皮、毛囊漏斗部、外根鞘。在羊駝皮膚中，c-KIT主要在毛囊永久部檢測到信號[8]。c-KIT在山羊皮膚中主要表達于上皮、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部、內(nèi)外根鞘，這與在其他物種中的報道相符，這提示c-KIT在山羊毛色形成過程中可能與在其他物種中所起的功能相似或相同。c-KIT在黑色山羊、白色山羊皮膚組織中的表達部位相同，而且其mRNA表達量無顯著差異，說明c-KIT在皮膚組織中的表達并不是導致試驗所選不同山羊毛色差異的主要因素。人角蛋白細胞和黑素細胞研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過紫外線誘導后，皮膚中c-KIT及其膜結(jié)合型的SCF配體的表達量顯著升高[9]，表明在SCF/c-KIT系統(tǒng)中，表皮黑色素著色過程起到調(diào)節(jié)作用，c-KIT在黑山羊、白山羊表皮中均有明顯表達，但觀察到的黑色素數(shù)量卻差異顯著，所以推測不同黑山羊、白山羊皮膚中還存在其他關(guān)鍵因素影響山羊表皮中黑色素的生成。在山羊皮膚組織中，c-KIT主要分布于表皮、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部、內(nèi)外根鞘的上皮細胞、毛球部的黑素細胞以及肥大細胞中。皮膚上皮細胞具有較強的分裂潛力，能夠分化為具有間充質(zhì)特性的細胞來修復組織損傷[10-11]。因此有學者認為，與KIT有關(guān)系的肥大細胞，部分種類的造血干細胞、生殖細胞、黑素細胞以及胃腸道的卡哈爾氏間質(zhì)細胞在特定條件下都具有較強的分裂能力[12-13]。因此c-KIT主要表達于具有較強分裂增殖潛力的細胞中，c-KIT還可能與皮膚細胞的更新有關(guān)。

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