高詩敏,鄧瑞林，2，閆芳，馬海利，化麗珍，田文霞，高文偉

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801； 2.南皮溫氏畜牧有限公司，河北 南皮 061500)

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2株山西IBV分離株的生物學特性研究

高詩敏1,鄧瑞林1，2，閆芳1，馬海利1，化麗珍1，田文霞1，高文偉1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801； 2.南皮溫氏畜牧有限公司，河北 南皮 061500)

摘要：[目的]控制地方雞傳染性支氣管炎病的流行。[方法]通過IBV-21、IBV-22半數(shù)感染量(EID50)試驗，雞胚矮小化試驗，干擾NDV LaSota復制試驗，雞胚氣管環(huán)試驗測定2毒株生物學特性。[結(jié)果]試驗結(jié)果顯示IBV-21的EID50為5×10-4.616·mL-1、IBV-22為5×10-6.5·mL-1；接毒胚明顯病變，2株毒對雞胚均有矮小化作用，對NDV LaSota有明顯干擾，對雞胚氣管環(huán)試驗病變明顯，RT-PCR的方法擴增2分離株的S1基因的特異條帶大小約為293 bp。[結(jié)論]該生物學特性顯示分離的2株病毒對雞胚有明顯致病作用且2毒株不是現(xiàn)存疫苗毒，為地方IBV疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：IBV； 生物學特性； RT-PCR； 分離鑒定

雞傳染性支氣管炎(AvianInfectiousBronchitis，IB) ，由傳染性支氣管炎病毒(IBVirus，IBV)引起雞的一種高度接觸性、急性呼吸道傳染病。主要侵害雛雞和產(chǎn)蛋雞，雛雞通常表現(xiàn)為喘氣、咳嗽等呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋雞表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降，導致雞免疫力下降而繼發(fā)其他疾病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。IBV由4種主要結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突(S)蛋白、 膜(M)蛋白、核衣殼(N)蛋白和小膜蛋白組成，S蛋白可以裂解為S1 和S2 蛋白，其中S1 蛋白與IBV的致病性和血清型有密切關(guān)系[1，2]。

IB于1930年春首次在美國北達科他州發(fā)現(xiàn)。1936年Beach和Schalm通過雞的交叉免疫試驗證實發(fā)病病原IBV與傳染性喉氣管炎病毒不同，再次確定病原IBV[3]。1937年Hudson首次利用雞胚培養(yǎng)該病毒獲得成功，并發(fā)現(xiàn)IBV可使雞胚致死，且Beaudette隨病毒連續(xù)傳代而致死性增強。在我國，華南農(nóng)業(yè)大學鄺榮祿教授于1982年首次報道腎型IB在全國各地廣泛流行[4]。由于IBV的血清型較多，其血清型間沒有或者僅有部分交叉保護力，而且有變異株和新血清型的出現(xiàn)，導致臨床免疫復雜化，常出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象[5]。

本文為了研究IBV地方毒株的特點，選取山西農(nóng)業(yè)大學傳染病試驗室保存的IBV分離株IBV-21、IBV-22測定生物學特性，并通過RT-PCR驗證，為IB的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1試驗材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1毒株和雞胚

2株IBV山西分離株：IBV-21、IBV-22，NDVLaSota由華南農(nóng)業(yè)大學傳染病試驗室饋贈，IBV標準陽性抗原、IBV陽性血清由山西省畜牧所饋贈。

9～11日齡SPF雞胚購自梅里亞。

1.1.2試劑

TrizolLSReagen購自Invitrogen公司，RNA抽提試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，胎牛血清、胰酶、M199培養(yǎng)基。

1.2試驗方法

1.2.1病毒的增殖

將IBV-21、IBV-22分別接種于10日齡SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)并棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，無菌收集72h尿囊液，按以上雞胚尿囊腔接種病毒傳代的方法，收取第三代病毒(F3)尿囊液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2半數(shù)感染量(EID50)測定

IBV-21、IBV-22病毒液用滅菌生理鹽水稀釋，設(shè)取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8，7個稀釋度，分別接種于10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種 5個10日齡SPF雞胚，接種量為每枚0.2mL，同時做生理鹽水空白對照，置于 37 ℃生化培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，棄去24h內(nèi)死亡胚，每8h照胚一次，觀察至144h，觀察并記錄雞胚發(fā)育、病變及死亡情況，按照Reed-Muench方法,其計算公式為：

距離比例=(高于50%的感染百分數(shù)-50%)/(高于50%的感染百分數(shù)-低于50%的感染百分數(shù))

LogEID50=高于50%的病毒稀釋度+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。

1.2.3矮小化試驗

將2株分離株病毒IBV-21、IBV-22病毒液用滅菌生理鹽水做 1∶10 倍稀釋。經(jīng)絨毛尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每個毒株接種5枚，接種量為每枚0.2mL，設(shè)生理鹽水為空白對照，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育，棄去24h內(nèi)死亡胚，逐日觀察，并測接毒后1周內(nèi)胚體重量。

1.2.4干擾NDVLaSota試驗

將IBV-21、IBV-22病毒液、NDVLaSota病毒液稀釋后經(jīng)絨毛尿囊腔接種于10日齡SPF雞胚，試驗分為3組，每組5枚SPF雞胚：第一組接種IBV-21尿囊液，每枚0.2mL，37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育12h后，在同一部位復種NDVLaSota病毒液，每枚0.2mL；第二組按同樣方法接種IBV-22病毒液后復種NDVLaSota病毒液；第三組為先接種生理鹽水然后復種NDVLaSota病毒液作為對照組。孵育3組雞胚，棄去24h內(nèi)死亡胚，無菌收取接種后36h尿囊液，按照常規(guī)微量法測定方法分組逐胚測定血凝價并計算平均血凝效價。

1.2.5IBV的血凝特性

將IBVIBV-21、IBV-22病毒液以50 000r·min-1離心20min后，分別取其上清，于37 ℃水浴3h，兩樣品分為2份，一份經(jīng)1%的胰蛋白酶處理，另一份為無處理上清作為空白對照，按照常規(guī)微量法測定方法測四份紅細胞凝集價[6,7]。

1.2.6IBV分離株TOC試驗

制備雞胚氣管環(huán)并觀察接毒后氣管環(huán)病理變化，采用等倍比稀釋病毒法測定TOC-ID50。在24孔細胞培養(yǎng)板中加入10-1～10-8倍比稀釋的病毒尿囊液，每孔加0.5mL，然后將培養(yǎng)好的雞胚氣管環(huán)放入各孔中，于5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中作用30min后，去除病毒液并加入M199培養(yǎng)液，其中含有2%的胎牛血清。每隔24h觀察并記錄氣管環(huán)活纖毛運動情況，直至144h。以氣管環(huán)纖毛運動停止和上皮細胞脫落作為病毒感染的指標。按照上述Reed-Muench方法計算各毒株的TOC-ID50，每個毒株測4次，取平均值。

1.2.7PCR測定

根據(jù)GenBank已公布的IBV基因組和基因序列，應(yīng)用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計擴增IBV的S1片段的引物，如下：

上游引物：5’-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3’；

下游引物：5’-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3’，

引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

按Invitrogen公司TrizolLS試劑說明書進行病毒RNA抽提，其RNA直接用于反轉(zhuǎn)錄或 -20 ℃凍存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)條件為循環(huán)參數(shù)為95℃變性3min，然后擴增循環(huán)30次，其程序為：94 ℃ 30s，52 ℃ 30s，72 ℃ 2min，最后72 ℃保持延伸7min，通過凝膠電泳方式分析擴增效果。

2試驗結(jié)果

2.1半數(shù)感染量(EID50)測定

IBV-21、IBV-22病毒稀釋液經(jīng)尿囊液接種10日齡非免疫雞胚，結(jié)果顯示均對雞胚致病且致死，雞胚接毒后144h，IBV-21按10-2～10-8稀釋度接種的陽性胚所占比例分別為 5/5、5/5、4/5、2/5、1/5、0/5、0/5，EID50為5×10-4.616·mL-1；IBV-22按10-2～10-8稀釋度接種的陽性胚比例為5/5、5/5、5/5、5/5、3/5、2/5、0/5，EID50 為5×10-6.5·mL-1；生理鹽水對照組陽性胚所占比例為0/5。

2.2矮小化試驗

分別對 10日齡SPF雞胚接種IBV-21、IBV-22孵育168h后，接種雞胚羊膜增厚并緊貼雞胚，胚體部分出現(xiàn)輕度出血，胚體明顯小于對照組的胚體，體重減輕，趾爪變形并抱緊頭部，胚體卷曲成球形，呈現(xiàn)侏儒胚，出現(xiàn)矮腳癥狀，羽毛發(fā)育不良。感染IBV-21、IBV-22病毒后，接種雞胚卷曲情況如圖1示；展開卷曲的胚體后，部分雞胚矮腳情況如圖2示。對照組雞胚發(fā)育正常，無明顯病變。

圖1　接種IBV-21、 IBV-22接種168 h的侏儒胚和正常對照胚的比較Fig.1　Vaccination IBV-21, IBV-22 inoculation of 168 h comparison of embryo dwarf embryo and normal controls　　注：正常為對照組，1～5為接毒后病變卷曲胚。Note: The normal was control group, 1～5 were pathological groups.

圖2　接種IBV-21、IBV-22接種168 h的雞胚的矮腳和正常對照胚的比較Fig.2　Comparison of 168 h and normal control embryos of chicken embryo inoculated with IBV-21 and IBV-22　　注：正常為對照組，矮腳1～3為接毒后病變卷曲胚。Note: The normal was control group, 1～3 were pathological groups.

雞胚體重變化如表1所示。與對照組比較，接IBV-21的5枚雞胚的胚體重量平均減輕13g，接種病毒IBV-22的5枚雞胚的胚體重量平均減輕11g，與接種生理鹽水的對照組相比，試驗組雞胚體重明顯降低。

2.3對雞新城疫病毒(LaSota株)的干擾試驗

IBV-21和IBV-22分別接種雞胚后，復種NDVLaSota株，接種IBV-21的雞胚尿囊液直接血凝價為2log2～4log2，平均值為2.8log2；接種IBV-22的雞胚尿囊液直接血凝價為 1log2～5log2，平均值為 3.2log2；而NDVLaSota對照組雞胚尿囊液血凝價為10log2。結(jié)果差異顯著 (P<0.01)，表明了分離株IBV-21和IBV-22均對NDVLaSota株在雞胚上的增殖有抑制，結(jié)果如表2所示。

2.4血凝特性試驗

IBV-21、IBV-22病毒液對雞紅細胞無凝集作用；但經(jīng)1%胰酶處理后，凝集價在5log2～7log2之間。

2.5TOC試驗測定結(jié)果

正常氣管環(huán)有清晰的輪廓，且管腔內(nèi)干凈透明，管壁上皮細胞完整，纖毛運動；攻毒后的氣管環(huán)表現(xiàn)出輪廓模糊，管腔內(nèi)有雜質(zhì)和氣泡，纖毛運動停止，見圖3。IBV-21、IBV-22的TOC-ID50值分別為2×10-5.6·mL-1，2×10-5.1·mL-1。

表1　接毒后第168 h雞胚胚體量/g

表2　IBV-21、IBV-21對NDV LaSota株干擾后的血凝價結(jié)果

圖3　雞胚氣管環(huán)感染試驗Fig.3　Infection of TOCs

2.6RT-PCR驗證結(jié)果

對IBV-21和IBV-22株毒進行基因S1的RT-PCR擴增鑒定，成功地擴增出一條約293bp的特異條帶，大小與預(yù)計的相吻合，陰性NDVLaSota沒有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。如圖4所示。

圖4　IBV-21和IBV-22的S1 基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4　RT-PCR amplification product electrophoresis of IBV-21 and IBV-22 S1 gene　　注：1. IBV-21的S1基因RT-PCR擴增結(jié)果；2. IBV-22的S1基因RT-PCR擴增結(jié)果；3. NDV LaSota株的RT-PCR擴增結(jié)果Note：1. RT-PCR amplification in S1 gene of IBV-21； 2.RT-PCR amplification in S1 gene of IBV-22； 3. RT-PCR amplification of NDV LaSota

3討論與結(jié)論

IB是對我國甚至全世界養(yǎng)禽行業(yè)造成嚴重危害的重大禽病之一。為了有效防治IB，首先要對其進行及時、準確的診斷和流行病學分析，分離鑒定病毒是常用手段。近年來隨著交通運輸和世界貿(mào)易的頻繁進行，導致IBV的地方毒株也有擴大流行的趨勢[8]。掌握IBV流行毒株的地方流行特點及其生物學特征，為正確及時防治疾病、疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。因此，快速分離、鑒定新變異毒株在雞傳染性支氣管炎的防治工作中十分重要[9]。

本試驗中測定IBV毒株生物學方法有重要意義。主要體現(xiàn)在：

(1)將病毒經(jīng)10日齡非免疫雞胚連續(xù)傳代且有明顯的致雞胚矮小化作用，說明病毒適應(yīng)雞胚培養(yǎng)且生長穩(wěn)定，IBV病毒分離和鑒定可以使用9～11日齡的雞胚、單層雞胚腎細胞和20日齡雞胚氣管環(huán)等宿主系統(tǒng)，其中以雞胚分離法更為簡便易行，該方法為測定其生物學特性奠定基礎(chǔ)；EID50測定試驗中IBV-21稀釋10-6倍、IBV-22稀釋10-7倍后，對雞胚仍有致死作用，由此推斷這2株毒為強毒，需要做動物試驗進一步證實。

(2)IBV對NDVLaSota毒株有干擾現(xiàn)象，用這一方法可簡便、快速診斷和鑒定IBV分離株，結(jié)果容易判定，而且具有較好的特異性干擾作用[10]。本試驗中的2株IBV對NDV-LaSota株的繁殖產(chǎn)生明顯的干擾作用，該方法可直接應(yīng)用病料的初次分離物。

(3)雞胚矮小化試驗鑒定IBV特異性強且操作簡單，但耗時長，初次分離病原需要在雞胚上盲傳4至5代以上，才能能觀察到矮小化特征；使用適應(yīng)雞胚的傳代病毒接種雞胚判定結(jié)果，也需要1周左右的時間，不宜作為鑒定IBV的首選方法。本試驗種接毒166小時后才觀察到雞胚矮小化現(xiàn)象。

(4)采取HA試驗可以排除具有凝血活性的病毒污染，本研究中對2株毒株測定HA值發(fā)現(xiàn)毒株對未處理雞紅細胞無凝集活性，雞紅細胞經(jīng)1%胰酶處理后，病毒對其有凝集活性，表明2株IBV中無NDV、AIV等凝集及紅細胞的病毒污染。IBV表面沒有凝集原，1%胰蛋白酶能使其產(chǎn)生血凝活性[11]。

(5)雞胚氣管環(huán)試驗代替試驗動物測定血清型，經(jīng)濟方便，但與動物體內(nèi)的反應(yīng)還是有較大的差異，因為當病毒侵入動物機體后，機體會啟動整個免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，而在TOC中的作用僅顯示部分。

(6)由于血清學方法不能區(qū)別疫苗株和野毒株，也不能確定新變異株的血清型，所以S1基因的RT-PCR和核苷酸序列測定就成了目前鑒定所有IBV血清型的唯一手段。

參考文獻

[1]卡爾尼克BW.高福，蘇敬良,譯.禽病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999(10):653-673.

[2]殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京:科學技術(shù)出版社，1997(2):675-680.

[3]SchalmOW,BeachJR.CulturalRequirementsoftheFowl-CoryzaBacillus[J].JBacteriol，1936, 31(2): 161-169.

[4]鄺榮祿，林紹儀.雞傳染性支氣管炎——腎病變型 [J]. 養(yǎng)禽與禽病防治，1982(3):27-28.

[5]代金芳. 雞傳染性支氣管炎疫苗使用概況[J]. 畜禽業(yè), 2014(12): 14-15.

[6]朱國強,莊國宏,周繼宏,等.雞腺胃型IBV分離株血凝性初探[J].中國畜禽傳染病,1997(6):30-31.

[7]SongCS,KimJH,LeeYJ,etal.DetectionandclassificationofinfectiousbronchitisvirusesisolatedinKoreabydot-immunoblottingassayusingmonoclonalantibodies[J].AvianDis，1998, 42(1): 92-100.

[8]SjaakdeWitJJ,CookJK,VanderHHM.Infectiousbronchitisvirusvariants：areviewofthehistory，currentsituationandcontrolmeasures[J].AvianPathology，2011，40(3)：223-235.

[9]王憲文，王巖，劉興友,等.雞傳染性支氣管炎病毒豫北株的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008(35): 15500-15502.

[10]RaggiLG,PignattelliP.IdentificationofinfectiousbronchitisvirusbyinterferencewiththeB-1isolantofNewcastlediseasevirus.Waxingandwaningofinterference[J].AvianDis，1975, 19(2): 334-342.

[11]SchultzBD,Cavanagn,GHerroer.Neuraminidasetreatmentofavianinfectiousbronchitiscoronavirusrevealsahemagglutinatingactivitythatisdependentonsialicacid_containningreceptorsonerythrocytes[J].Virology,1992,189(2):792-794.

(編輯：武英耀)

BiologicalcharacteristicsoftwostrainsofShanxiIBVisolates

GaoShimin1,DengRuilin1,2,YanFang1,MaHaili1,HuaLizhen1,TianWenxia1,GaoWenwei1

(1．College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801，China; 2．Nanpi Wens Animal Husbandry co., LTD，Nanpi 061500,China)

Abstract:[Objective]The aim was to control the epidemic of infectious bronchitis.[Methods]The biological characteristics of IBV-21 and IBV-22 were tested by infection of half quantity (EID50), chicken embryos small test and interference NDV LaSota copy test and chicken embryo TOCs experiment. We verified by RT-PCR amplification. [Results]The results showed that the EID50 of IBV-21 was 5×10-4.616·mL-1, IBV-22 was 5×10-6.5·mL-1. Two strains had poison to chicken embryos that to be a little change as a result, the NDV LaSota interfered markedly, and chicken embryo TOCs was showed the lesions. The RT-PCR amplified S1 gene of 2 isolates, and stripe size was about 293 bp. [Conclusion]The biological characteristics showed that the separation of two viruses which was not existing vaccines had obvious pathogenic role in chicken embryos, and laid the foundation in local IBV vaccine development.

Key words:IBV; Biological Characteristics; RT-PCR;Separation Identification

收稿日期：2016-04-17 修回日期：2016-04-30

作者簡介：高詩敏(1985-)，女(漢)，山西太谷人，講師，博士，研究方向：獸醫(yī)傳染病學

基金項目：山西農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新基金(412579)

中圖分類號：S855.3

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)07-0472-05