紀薇，王瑞，狄娟，劉榕晨，羅堯幸，茹慧玲，楊忠義*

(1.山西農業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.山西省農科院 果樹研究所，山西 太谷 030800)

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亳菊試管嫁接苗褐變生理機制研究

紀薇1，王瑞1，狄娟1，劉榕晨1，羅堯幸1，茹慧玲2，楊忠義1*

(1.山西農業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.山西省農科院 果樹研究所，山西 太谷 030800)

摘要：[目的]揭示亳菊試管微嫁接過程中組培苗發(fā)生褐變的生理機制。[方法]本研究以亳菊外植體為研究材料，使用福林酚法和多酚氧化酶活性測定法，對發(fā)生褐變的亳菊微嫁接苗總酚含量、多酚氧化酶活性以及褐變指數進行測定。[結果]亳菊微嫁接苗褐變級數越高，發(fā)生褐變的情況越嚴重，4級褐變率(89.7%)顯著高于其他褐變級數；隨著褐變級數的增大，亳菊試管微嫁接苗組織內總酚含量降低，多酚氧化酶活性增強，即褐變級數與外植體總酚含量成負相關，與多酚氧化酶活性成正相關。[結論]本研究為提高亳菊試管微嫁接效率提供了理論依據。

關鍵詞：菊花； 菊試管微嫁接； 褐變

亳菊(Dendranthema morifolium (Ramat.)Tzve.l‘Boju’cv.nov.) 為多年生草本植物，菊科菊屬，是藥用菊花中重要的一種，主要產于安徽亳州，為四大名菊之一，觀賞價值高，有疏風散熱、解暑明目等藥用價值[1,2]。由于亳菊生活范圍逐漸縮小，并且農民為獲得更高利潤而更換種植種類，使得亳菊種質資源急劇減少。為了緩解土地壓力以及快速改良品種性狀，組培成為植物快速繁殖的重要手段，并且采用試管微嫁接技術達到大量生產優(yōu)質脫毒苗的目的。然而，亳菊同其他植物外植體一樣，在組培過程中，自身組織會從外表向培養(yǎng)基釋放褐色物質，使培養(yǎng)基逐漸變?yōu)楹稚庵搀w也逐漸枯萎死亡[3]。

組織培養(yǎng)過程中亳菊試管微嫁接苗培養(yǎng)過程中因褐變導致植株死亡情況嚴重。本試驗以不同褐變程度的亳菊微嫁接苗為材料，對其總酚含量、多酚氧化酶活性及褐變指數進行測定并進行相關性分析，旨在為優(yōu)化亳菊試管微嫁接技術體系提供理論依據和實踐指導。

1材料與方法

1.1試驗材料

山西農業(yè)大學園藝站位于山西省晉中市太谷縣山西農業(yè)大學(37°43′N，112°59′E)，土壤以褐土為主，為溫帶大陸性氣候。本試驗選取亳菊的幼嫩莖段與莖尖為試驗材料，對發(fā)生褐變嫁接苗進行動態(tài)觀察和指標測定。

1.2儀器和試劑

儀器：臺式冷凍離心機(型號：PRIMOR；產地：德國)，雙人單面垂直潔凈工作臺(型號：SW-CJ-2FD；產地：上海)，紫外分光光度計(型號：UV-7504；產地：上海)，恒溫水浴鍋(型號：HH-2：產地：常州)。

試劑：福林酚(購自北京華邁科生物技術有限責任公司)，鄰苯二酚、丙酮、無水乙醇、沒食子酸、磷酸、檸檬酸、碳酸鈉(均購自徐州索通生物科技有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1試管微嫁接

將試驗材料放入大燒杯中，紗布封口后用流水沖洗2h左右，然后將外植體在超凈工作臺上用75%酒精消毒30s，蒸餾水清洗3遍后，用10%次氯酸鈉消毒10min，再用蒸餾水清洗3遍，在濾紙上吸干外植體表面水分。用剪刀將植物材料分為莖段與莖尖兩個部分，去除植物較大的葉片，留1～2片小葉片[4～6]。將莖段的上端平切，下端斜切。沿砧木頂部縱切，長度約0.5cm，選粗度與砧木相近的接穗，留頂部1～2片葉子, 并將其基部成楔形(長約0.5cm)。將接穗插入砧木中，用錫鉑紙將接口部位綁緊。最后把嫁接好的試管苗接入ER培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)[7～9]。

1.3.2多酚氧化酶活性的測定

多酚氧化酶活性測定試驗采用印芳等[10]的方法，稍作改良?；静襟E如下：將混合的材料稱取0.5g，在預冷后的研缽中加入磷酸-檸檬酸緩沖液冷凍研磨提取，待充分研磨后定容至10mL(低溫操作)，用低溫離心機離心15min，轉速與溫度分別為3 000r·min-1、0～4 ℃，離心后所得的上清液即為多酚氧化酶待測液。量取待測液5mL，再加入5mL反應體系(4.0mL0.1mol·L-1磷酸—檸檬酸緩沖液，1.0mL1%鄰苯二酚)，充分反應2min后，將混合液在30 ℃的水浴上保溫30min。取出液體4min后在波長為460nm處測定吸光度值[10]。

測量多酚氧化酶活性試驗，試驗重復3次，測量吸光值時以每分鐘A460變化 0.01為一個多酚氧化酶活性單位(U)。

多酚氧化酶活性/U·(g·min)-1=(A460×VT)/(W×VS×0.01×t)

式中：A460：反應時間內吸光度的變化；W：樣品鮮重/g；t:反應時間/min；VT：提取酶液總體積/mL；VS：測定時取用酶液體積/mL。

1.3.3總酚含量的測定(沒食子酸為標準曲線)

試驗采用Folin-Ciocalteu試劑法，總酚含量的測定采用徐輝艷等[11]的方法，并有一定的改進?；静襟E如下：稱取0.5g的混合材料冷凍保存，研磨，定容，量取制備好的液體0.5mL于50mL容量瓶中， 加30mL蒸餾水搖勻，再加入2.5mL福林酚試劑和7.5mL20%碳酸鈉溶液，定容，水浴10min，溫度為75 ℃，待冷卻后于760nm波長下比色測定吸光度值。試驗重復3次[11]。

標準液的配置：稱取0.005g沒食子酸標準樣，用蒸餾水溶解并定容至50mL。量取制備好的溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于50mL容量瓶中，各加30mL蒸餾水搖勻，再加2.5mL福林酚試劑，充分搖勻，待反應1min后再加入20%碳酸鈉溶液7.5mL，搖勻定容。75 ℃水浴10min，冷卻后于760nm波長下比色測定吸光度，建立標準曲線[11]。

1.3.4總酚含量的測定(鄰苯二酚為標準曲線)

試驗采用Folin-Ciocalteu試劑法，總酚含量的測定采用Bonilla等[12]的方法，并有一定的改進?；静襟E如下：取0.5g材料，加入3mL95%乙醇研磨成勻漿狀，過濾，用95%乙醇定容至25mL。取2mL待測液于10mL離心管中，先加入2mL福林試劑，搖勻靜置3min后加入10%碳酸鈉2mL震蕩。避光處理1h后在765nm處比色測定[12]。試驗重復3次。

標準曲線的制定：稱取10mg鄰苯二酚樣品溶解于100mL蒸餾水中，分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的鄰苯二酚溶液于10mL離心管中，再分別加入2mL福林酚試劑和2mL10%碳酸鈉溶液，最后加入2、1.9、1.8、1.7、1.6和1.5mL蒸餾水，黑暗靜置1h后在波長765nm處測量吸光度值[12]。

1.3.5褐變指數的測定

褐變指數=∑(褐變級數×該病級株數)/(總株數×4)×100%[13]

表1　褐變分級方法[13]

1.4數據處理

試驗采用單因素隨機處理，設3個處理，每個處理重復3次。數據處理使用WordprocesssystemOffice軟件進行平均值、誤差分析，各處理的平均值采用TheSASSystemforWindowsV8進行多重比較檢驗與顯著性分析，采用Excel整理多重比較檢驗與顯著性分析的結果，并用Excel作圖。

2結果與分析

2.1亳菊試管微嫁接苗褐變動態(tài)觀測

2.1.1亳菊試管微嫁接苗的不同發(fā)生部位褐變動態(tài)觀測

亳菊微嫁接苗在組培的過程中發(fā)生的褐變位置不同，可分為3種情況。第一種為嫁接苗的接穗先發(fā)生褐變，外植體由上而下逐漸變?yōu)楹稚?。第二種為嫁接苗的接穗與砧木嫁接處先發(fā)生褐變，然后逐漸向嫁接苗的兩端蔓延。第三種為嫁接苗的砧木先發(fā)生褐變，然后由下而上褐變逐漸蔓延。分析原因，這可能是由于選取的外植體本身的生理狀態(tài)、取材時間不同以及外植體受到各種機械損傷(如流水沖洗、砧木和接穗的處理等)，使得嫁接苗褐變的位置不同。如圖1所示。

圖1　亳菊試管嫁接苗在不同部位發(fā)生褐變(嫁接于2015-09-25)Fig.1　Grafting of Chrysanthemum Plantlets from different parts of Chrysanthemum(grafted on 2015-09-25)　　注：A ：嫁接后4 d后接穗先發(fā)生褐變；B：嫁接后6 d后嫁接切口處先發(fā)生褐變；C：嫁接后6 d砧木先發(fā)生褐變。Note: A: grafting after 4 days after scion to browning; B: after grafting 6 days after grafting the incision to browning; C: after grafting 6 d rootstock first browning.

2.1.2亳菊試管微嫁接苗生長發(fā)育動態(tài)觀測

亳菊嫁接苗于2015年9月21日嫁接接種，組織培養(yǎng)9d后外植體表面較少部分變?yōu)樽睾稚?；培養(yǎng)14d后外植體整體顏色變淡，呈棕褐色，培養(yǎng)基開始變色；培養(yǎng)21d后，外植體開始枯萎，培養(yǎng)基顏色加深，基部有黃色菌落。如圖2所示。

圖2　亳菊試管嫁接苗褐變情況(于2015-09-21嫁接)Fig.2　The browning situation of chrysanthemum tube grafted culture (in 2015-09-21 grafting)　　注：A為培養(yǎng)9 d后亳菊試管嫁接苗褐變情況，B為培養(yǎng)14 d后亳菊試管嫁接苗褐變情況，C為培養(yǎng)21 d后亳試管嫁接苗褐變情況Note: A.Browning of test tube grafted seedlings cultured in vitro after 9 days. B.Browning of test tube grafted seedlings cultured in vitro after 14 days. C.Browning of test tube grafted seedlings cultured in vitro after 21 days

2.2亳菊試管微嫁接苗褐變指數分析

在亳菊組培的過程中，外植體常常在接種后發(fā)生褐變，情況輕時僅會使培養(yǎng)基變?yōu)樽睾稚瑖乐貢r會阻礙植株的生長、分化，甚至使植株死亡。在試驗過程中，當嫁接苗組培到第1d時，各個組培苗開始出現(xiàn)不同程度的褐變情況，大部分嫁接苗褐變速度極快，平均6d左右達到4級褐變，外植體生長受到阻礙，不分化，嫁接苗全部變?yōu)楹稚⑶宜劳?。極少數褐變級數為1級。由表2可見，在亳菊經試管微嫁接后，通過30d左右的培養(yǎng)后，亳菊嫁接苗褐變情況嚴重，嫁接苗的正常生長受到嚴重的阻礙，并且有些嫁接苗已經死亡，極少數嫁接苗發(fā)生分化，4級褐變顯著高于0、1、2、3級(P<0.01)，褐變指數為0.95。

表2　亳菊試管微嫁接苗褐變情況

注：表中為平均值 ±標準誤差，同列不同大寫字母表示差異顯著(α=0.01)，P<0.01

Note:Valuesrepresentthemeans±SE，Differentcapitallettersinsamecolumnmeansignificantdifference(α=0.01), P<0.01

2.3亳菊試管嫁接苗多酚氧化酶活性的變化

亳菊試管嫁接苗組培1d后外植體不同部位開始出現(xiàn)褐變，并逐漸蔓延。從圖3可以看出，亳菊嫁接苗的褐變級數與多酚氧化酶(PPO)的活性呈正相關。形狀、大小基本一致的試管嫁接苗褐變級數分別為2、3、4時，亳菊嫁接苗的多酚氧化酶(PPO)活性差異顯著，顯著性P值為0.0005。當褐變級數為4級時，褐變情況最為嚴重，亳菊嫁接苗的多酚氧化酶活性最高。

圖3　褐變級數不同的亳菊嫁接苗多酚氧化酶活性變化Fig.3　Browning different stages daisy grafted polyphenol oxidase activity changes

2.4不同測定方法對亳菊微嫁接苗總酚含量的影響

圖4為鄰二苯酚標準曲線，通過處理數據，得到線性關系式：C鄰苯二酚=0.866 87+4.514 08A吸光值(R2=0.962 6)，回歸模型的P值為0.000 5，決定系數為0.96。結果表明回歸模型有較高的擬合精度，鄰苯二酚總酚含量的標準曲線圖具有良好的線性相關。通過此公式與相關的試驗數據得出不同程度褐變的亳菊嫁接苗的總酚含量。

圖4　鄰苯二酚標準曲線Fig.4　Catechol standard curve

圖5為沒食子酸標準曲線，通過數據處理，得到線性關系式：C沒食子酸=0.014 17+8.809 78A吸光值(R2=0.962 6)，回歸模型的P值為小于0.000 1，決定系數為0.993 0。結果表明回歸模型有較高的擬合精度，沒食子酸總酚含量的標準曲線圖具有良好的線性相關，通過此公式與相關的實驗數據得出不同程度褐變的亳菊嫁接苗總酚含量。

圖5　沒食子酸標準曲線(亳菊)Fig.5　Gallic acid standard curve (Daisy)

由圖6可以看出，亳菊組培苗褐變級數與總酚含量呈負相關。當褐變級數低時，亳菊總酚含量較高，當組培苗的褐變級數增大時，褐變越加嚴重，總酚含量降低。經檢驗，總酚含量差異顯著，顯著性P值為0.000 3。用不同的方法測定亳菊組培苗的總酚含量時，測得的總酚含量都呈下降趨勢，但測出的結果略有差異。用沒食子酸測出的總酚含量總體偏高，并且下降趨勢快于以鄰苯二酚為標準曲線測得的總酚含量，當組培苗的褐變級數逐漸增大時，兩種方法測得的總酚含量差值逐漸減小，但兩種方法測得的總酚含量都呈下降趨勢。

圖6　以不同標準曲線測得亳菊總酚含量比較圖Fig.6　In different standard curve measured chrysanthemum total phenol content comparison chart

3討論

試管微嫁接技術不僅可以消除植物本身所帶病毒，還可以優(yōu)化品種性狀，是優(yōu)良品種快速繁殖的重要手段。目前為止，試管微嫁接技術已經廣泛應用于葡萄、龍眼、香梨等植物的快速繁殖，并積累了大量的參考依據。付宏岐等[14]為了解決轉基因紅花植物生根困難的問題，通過不同莖尖微嫁接方式獲得成活嫁接苗，建立了紅花離體微試管嫁接的方法，為紅花生根提供了新的途徑以及為提高嫁接苗成活率奠定理論基礎。

在組培試驗過程中，褐變問題是普遍存在的，研究至今，眾多科學家對植物組織培養(yǎng)過程中外植體發(fā)生褐變的現(xiàn)象已有大量研究[15～17]?？偨Y原因主要有非酶促褐變與酶促褐變兩大主要因素，非酶促褐變是由外界條件引起的，酶促褐變是內在因素引起的[17]。本試驗中，酚類物質與多酚氧化酶在亳菊完整的植物體細胞中以穩(wěn)定狀態(tài)分隔存在，當外植體在處理時組織的完整性受到破壞，打破酚類化合物與多酚氧化酶的存放狀態(tài)，二者相遇后酚類化合物在多酚氧化酶的催化下氧化形成醌類物質和水，進一步導致其他酶系失活，造成組織代謝活動紊亂，外植體生在代謝停滯，最后衰老死亡[13]。

大量的研究結果表明，褐變的發(fā)生與外植體的種類、年齡、取材部位、取材時間、外植體大小以及受傷害程度密切相關，很多因素都會影響植物體內的酚類物質的含量從而造成不同程度的褐變。這與本試驗研究結果一致，分析原因可能是由于亳菊中含有大量的黃酮、多酚、綠原酸等活性物質，并且在溫暖多雨的秋季取材，材料本身較老，體內酚類含量高[3]。

本試驗中不同褐變程度亳菊嫁接苗中總酚與多酚氧化酶活性的變化結果表明，在亳菊嫁接苗培養(yǎng)一定天數以后，測得外植體總酚含量與多酚氧化酶各不相同，亳菊嫁接苗褐變級數增大時，酚類物質在多酚氧化酶的作用下氧化為醌類物質形成聚合物，總酚含量逐漸降低，多酚氧化酶活性逐漸增強，褐變級數與總酚含量成負相關，與多酚氧化酶活性成正相關，多酚氧化酶活性越高，外植體褐變越嚴重。符真珠等提出，在離體培養(yǎng)后,隨著褐變加重，PPO的活性增強，而總酚的含量下降[18]。許傳俊等研究成果顯示褐變的產生可能不但因為酚的氧化，在褐變過程中酚類化合物的增多為主要原因，有待進一步研究[19]。

4結論

因褐變與外植體內總酚含量關系密切，使用總酚含量較低的植物進行微試管嫁接組培更加容易。亳菊微試管嫁接苗組培時出現(xiàn)不同程度褐變，由于褐變嚴重程度不同，嫁接苗的多酚氧化酶(PPO)活性與總酚含量相應變化。隨著組培時間的延長,亳菊嫁接苗的褐變級數增大，多酚氧化酶(PPO)活性升高，總酚含量降低。

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(編輯：馬榮博)

Studyonphysiologicalmechanismofbrowningin vitrograftingofDendranthema morifolium (Ramat.)Tzvel‘Boju’cv.Nov.

JiWei1，WangRui1，DiJuan1，LiuRongchen1，LuoYaoxing1，RuHuiling2，YangZhongyi1*

(1． College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China； 2.Shanxi Academy of Agricultural Science Institute of fruit trees, Taigu 030800, China)

Abstract:[Objective]To reveal the mechanism of browning in the process of micro-graft in vitro in Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel ‘Boju’cv.Nov. [Methods]The Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel ‘Boju’cv.Nov. was used as explant, and the total phenolic content, polyphenol oxidase activity and browning index of in vitro browned grafts were detected by Folin Method and Polyphenol oxidase Method. [Results]The results showed that with the increasing of browning series, the browning situation was more serious. The browning ratio of series 4(89.7%) was significantly greater than other browning series. The greater the browning series was, the total phenolic content was decreasing, meanwhile the polyphenol oxidase activity in the in vitro grafts was increased. There was a linear negative correlation between the browning series and the explant total phenolic content, and there was a linear positive correlation between the browning series and the polyphenol oxidase activity. [Conclusion]This study providing the theory basis for increasing the efficiency of Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel ‘Boju’cv.Nov. in vitro grafts.

Key words:Chrysanthemum; Micro-graft in vitro； Browning

收稿日期：2016-05-12 修回日期：2016-06-05

作者簡介：紀薇(1983-)，女(漢)，陜西三原人，博士，副教授，研究方向：植物組織培養(yǎng)與生物技術育種 *通訊作者：楊忠義，副教授，博士，碩士生導師。Tel：13935406903；E-mail:yang_zhongyi092@163.com

基金項目：山西省科技基礎條件平臺建設項目(201509016)；國家自然科學基金(31401834)；山西農業(yè)大學青年拔尖創(chuàng)新人才支持計劃(TYIT201401)

中圖分類號：S682.31

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)07-0489-06