白宇琛，謝金峰，周廣防，馮秀麗

(南京農(nóng)業(yè)大學，動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

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雞大腸桿菌FimH基因C端結(jié)構(gòu)域克隆及特性分析

白宇琛，謝金峰，周廣防，馮秀麗*

(南京農(nóng)業(yè)大學，動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

摘要：[目的]通過進一步研究禽大腸桿菌 I 型菌毛主要結(jié)構(gòu)基因FimH的基因結(jié)構(gòu)及其抗原特性 ，為深入探索雞大腸桿菌致病機理及研制基因工程疫苗奠定必要的理論基礎(chǔ)。[方法]本文以已發(fā)表的Fim H 基因C端核酸序列為參考序列，設計并合成引物，擴增雞大腸桿菌JS1、JS2、JS6三個菌株的Fim H 相應基因，使用Lasergene軟件對其進行序列比對、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測以及進化樹的繪制等。[結(jié)果]JS1、JS2、JS6三個菌株的核酸同源性分別為97.3%、97.7%和97.3%，而氨基酸序列的相似性分別為95.3%、97.6%和95.3%。此外，其抗原決定簇基本相似，但在第78和79位抗原決定簇不同，這說明本研究中的3個雞大腸桿菌菌株的Fim H基因序列及氨基酸序列的變異可能對Fim H蛋白抗原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了輕微影響。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，本實驗室分離的3株雞大腸桿菌菌株FimH基因與選擇的國內(nèi)雞大腸桿菌菌株的Fim H基因同源性比較高，同處于一個進化分支中。[結(jié)論]本研究結(jié)果表明雞大腸桿菌I型菌毛Fim H基因未發(fā)生明顯變異，這為后續(xù)研究Fim H基因的功能及其基因工程亞單位疫苗研發(fā)提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞大腸桿菌； Fim H基因； 克隆； 特性分析

雞致病性大腸桿菌( avian pathogenic E． coli，APEC)主要通過呼吸道感染禽類，能導致禽類發(fā)生腹膜炎、輸卵管炎、氣囊炎、眼炎和敗血癥等多種傳染性疾病。隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，禽大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的細菌性傳染病之一[1～3]。目前APEC的致病機制尚未完全闡明，且無有效的疫苗防疫禽大腸桿菌病，故研究雞大腸桿菌FimH基因結(jié)構(gòu)及其抗原特性，對弄清大腸桿菌致病機理及研制I型菌毛基因工程疫苗均具有重要意義。據(jù)報道，黏膜表面上皮細胞表面的糖蛋白2可以特異性地與APEC表面的Fim H結(jié)合[4,5]。多數(shù)APEC具有I型菌毛，因其對機體呼吸道的粘附起著重要作用，APEC能在雞機體內(nèi)定居、增殖，進而侵襲入機體內(nèi)[6～8]。因此菌毛是APEC最為重要的致病因子。I型菌毛操縱子基因由染色體基因控制，其中Fim H 是大腸桿菌I型菌毛的主要結(jié)構(gòu)基因[9,10]。本研究致力于用分子生物學的方法，擬以已發(fā)表的FimH基因序列為參考序列，設計并合成引物，克隆由本實驗室保存的雞大腸桿菌JS1，JS2，JS6三個菌株的Fim H 基因，使用Lasergene軟件進行序列比對、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測以及進化樹的繪制等。研究結(jié)果為篩選通用性的1型菌毛Fim H抗原表位提供了便利條件，也為后續(xù)分析比較不同結(jié)構(gòu)Fim H及其可能的基因工程疫苗奠定必要的研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒

禽病原性大腸桿菌JS1、JS2、JS6分離株由南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)學傳染病組實驗室保存。pMD18-T載體購自TakaRa公司。

1.2主要試劑

PCR體系試劑盒、膠回收試劑盒等均購自TakaRa公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設計及合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的參考序列(JX847135.1)，采用Primer5.0 軟件設計一對引物后送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表1所示。引物用超純水溶解并稀釋至25pmol·L-1，置于-20 ℃凍存。

表1　基因FimH的引物設計

1.4模板DNA的制備

參照文獻[11]方法，提取大腸桿菌染色體DNA為模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?。提取方法略作改動，細菌收集時使用5倍量0.15mol·L-1NaCl-0.1mol·L-1Tis(pH8.0)-0.01%SDS溶液懸浮離心沉淀。

1.5FimH基因的 PCR擴增

以提取的模板DNA進行PCR擴增，應用上下游引物進行Fim H基因的PCR擴增。PCR反應體系為：模板DNA1.5μL；Mix12.5μL；上游、下游引物各0.5μL；ddH2O10μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性 5min; 90 ℃變性30s, 60 ℃退火 30s, 72 ℃延伸 30s, 30個循環(huán); 結(jié)束后 72 ℃延伸 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。使用DNA膠回收試劑盒對PCR反應產(chǎn)物進行純化回收。連接pMD18-T載體送上海英駿生物有限公司進行克隆片段的DNA序列測定。

1.6Fim H基因序列及抗原決定簇分析

用生物軟件DNA-STAR輸入所測得的核酸序列進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1PCR結(jié)果

各取三株菌株的Fim H 基因PCR擴增產(chǎn)物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳，可見單一并清晰的條帶，大小與預期結(jié)果258bp相符(圖1)。

圖1　三株雞源大腸桿菌1型菌毛FimH基因PCR結(jié)果Fig.1　Cloning of C terminal domain of Fim H gene of three avian E.coli strains by PCR　　注：M：DNA Maker ；1：JS1；2：JS2； 3：JS6; 4：空白對照組Note： M：DNA Maker ；1：JS1；2：JS2； 3：JS6; 4:Blank

2.2PCR產(chǎn)物序列測定及分析

將測定的Fim H基因PCR產(chǎn)物序列用Lasergene軟件進行分析。如圖2～圖4所示，分離株JS1、JS2、JS6與GenBank所公布序列核苷酸序列(GenBank:JX847135.1)的核酸同源性分別為97.3%、97.7%和97.3%，氨基酸序列的相似性分別為95.3%、97.6%和95.3% ，其中JS1與JS6的同源性為100%。

2.3預測蛋白主要抗原特征

用Lasergene軟件預測分離毒株與標準株抗原性如圖5所示。結(jié)果表明分離株JS1與JS6的抗原性完全相同，而與JS2差異在73～85位氨基酸處較顯著，雖然在22處，JS1和JS6菌株FimH為A，而JS2菌株FimH為V，但并不影響其蛋白抗原特性。而78和79位的氨基酸變化，對FimH蛋白抗原決定簇影響很大。如圖3所示，JS1和JS6菌株FimH中，78和79位氨基酸分別為L和H，而JS2菌株FimH的該位置氨基酸分別為P和R，標準株FimH的該位置氨基酸分別為Q和R。這表明雞大腸桿菌FimH抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變。

2.4同源序列的進化樹分析

使用Lasergene軟件對分離的JS1、JS2、JS6和標準株以及在NCBI中挑選的國內(nèi)已發(fā)表的其他同源株序列進行進化樹的繪制，結(jié)果如圖6所示。JS1株和JS6株與JN408550.1、JN408559.1的核苷酸同源性為100%，說明其進化關(guān)系最近，而與CP002291.1親緣關(guān)系較遠。JS2株處于稍微偏遠的一個進化分支。從進化樹圖譜中可以看出，本實驗室分離的3種雞大腸桿菌菌株沒有發(fā)生太大的變異，與選擇的大多數(shù)大腸桿菌對照菌株的同源性比較高，處于一個進化分支中。

圖2　雞源大腸桿菌1型菌毛FimH基因與標準株FimH核酸序列比較Fig.2　Nucleotide sequences comparisons of C terminal domain of Fim H gene from three isolated and reference avian E.coli strains

圖3　雞源大腸桿菌與標準株1型菌毛FimH氨基酸序列比較Fig.3　Amino acid comparisons of C terminal domain of Fim H gene from three isolated and reference avian E.coli strains

圖4　雞大腸桿菌與標準株1型菌毛FimH基因同源性比較Fig.4　Homology comparisons of C terminal domain of Fim H gene from three isolated and reference avian E.coli strains

圖5　雞大腸桿菌與標準株菌毛Fim H蛋白抗原決定簇圖譜Fig.5　Antigenic determinant analysis of C terminal domain of Fim H gene from three isolated and reference avian E.coli strains

圖6　同源核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.6　Phylogenetic tree of homologous nucleotide sequence from various avian E.coli strains

3結(jié)論與討論

FimH蛋白是雞大腸桿菌Ⅰ型菌毛主要的結(jié)構(gòu)蛋白[9,10]。國內(nèi)外研究人員對雞大腸桿菌Ⅰ型菌毛的Fim H基因及其功能進行了深入研究。戴鼎震等[12]發(fā)現(xiàn)國內(nèi)O11、O78和O18血清型分離株1型菌毛基因與國外同源菌株的核酸序列和氨基酸序列同源性分別在97%和98%以上。何素芬等[13]構(gòu)建了禽致病性大腸桿菌型菌毛Fim H 基因缺失突變株，為進一步深入研究禽大腸桿菌I型菌毛與機體相互作用的分子機制提供了基礎(chǔ)。尹曉琳等[14]對尿路致病性大腸桿菌臨床株I型菌毛FimH基因進行了檢測，發(fā)現(xiàn)FimH 基因存在于大多數(shù)尿路致病性大腸桿菌臨床株中。據(jù)報道，F(xiàn)imH蛋白由兩個結(jié)構(gòu)域組成，其中N端具有特異性粘附宿主呼吸道上皮的能力，而C端結(jié)構(gòu)域(氨基酸160～279)則將Ⅰ型菌毛中的Fim H與Fim G連接在一起[15,16]。因此，F(xiàn)imH蛋白的C端結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌致病作用中發(fā)揮了重要作用。鑒于此，本研究中根據(jù)國外報道的Fim H基因的C端核酸序列，設計特異引物，擴增了本實驗分離的三株雞大腸桿菌的Fim H的相應基因。根據(jù)核酸序列和氨基酸序列同源性分析結(jié)果可以看出，該三株雞大腸桿菌JS1、JS2、JS6之間以及與國外報道菌株的Fim H基因核酸序列同源率在97.3%～100%之間，氨基酸序列同源率為95.3%～100%間，具有高度的保守性。

通過MegAlign軟件對其抗原決定簇進行預測分析，發(fā)現(xiàn)該Fim H基因的第78和79位的氨基酸變化對其抗原決定簇影響較大，并導致了73～85位氨基酸處抗原決定簇有明顯差異，暗示著該位點氨基酸的變異對FimH抗原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，提示其粘附能力和致病性也可能存在差異。此外，對JS1、JS2、JS6分離株和國外報道菌株以及在NCBI中挑選的國內(nèi)已發(fā)表的其他菌株進行Fim H基因序列進化樹分析，結(jié)果顯示三株雞大腸桿菌分離株沒有發(fā)生太大的變異，與選擇的大多數(shù)大腸桿菌菌株的同源性比較高，處于一個進化分支中。

鑒于雞大腸桿菌I型菌毛Fim H基因未發(fā)生明顯變異，這為篩選通用性的Ⅰ型菌毛Fim H抗原表位提供了便利條件。大腸桿菌表面Fim H基因的不同結(jié)構(gòu)域及其功能差異，可能與其結(jié)合能力和免疫刺激活性有關(guān)。本研究擴增的3種Fim H基因為后續(xù)研究Fim H基因的功能及其基因工程亞單位疫苗研發(fā)提供了重要的實驗基礎(chǔ)。

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(編輯：馬榮博)

Cloning and characterization of C terminal domain ofavianE.coli’FimHgene

Bai Yuchen， Xie Jinfeng， Zhou Guangfang， Feng Xiuli*

(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095，China)

Abstract:[Objective]Through further study of Fim H, the the main structure gene of avian Escherichia coli type I, the research aimed to provide necessary theoretical foundation for pathogenic mechanism of avian E.coli and development of gene engineering vaccinE.[Methods] Based on the published C terminal domain nucleotide sequence of Fim H gene for reference, this research designed and synthesized primers, amplified three strains of the relevant Fim H genes in avian E.coli including JS1, JS2 and JS6, used Lasergene software for sequence alignment and protein structure prediction, and the evolutionary tree was drew, etc. [Results] The results showed that the homology of gene nucleotide sequences between Reference strain and JS1, JS2 or JS6 were 97.3%, 97.7% and 97.3%, and their amino acid sequences was 95.3%, 97.6% and 95.3%, respectively. Although their Fim H antigenic nucleotide sequences between Reference strain and JS1, JS2 or JS6 were 97.3%, 97.7% and 97.3%, and their amino acid sequences was 95.3%, 97.6% and 95.3%, respectively. Although their Fim H antigenic determinants are basically similar, amino acids changes at 78thand 79thcaused the different antigenic determinant at C terminal domain of Fim H, which indicated that amino acid variation of Fim H sequences might have the minor effect on the antigenic property of Fim H. Furthermore, the evolutionary tree analysis showed the close evolutionary relationship among three isolated strains and the domestic avian E.coli strains. [Conclusion] The results indicated that the Fim H gene of avian E.coli had no significant variation, which makes important foundation for further research on molecular mechanism of avian E.coli and the control strategies against pathogenic avian E.coli.

Key words:Avian E.coli; Fim H gene; Gene clone; Characterization analysis

收稿日期：2016-03-02 修回日期：2016-04-12

作者簡介：白宇琛(1995-)，女(漢)，山西呂梁人，研究方向：畜禽傳染病防治、動物病毒分子免疫學 *通訊作者：馮秀麗，副教授，博士，碩士生導師。Tel：13605199873；E-mail：xiulifeng@njau.edu.cn

基金項目：江蘇省自然科學基金青年基金項目(BK20130682)；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)

中圖分類號：S852.61

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)07-0467-05