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基于熒光檢測(cè)的糜子Genic-SSR PCR體系優(yōu)化

2016-07-21 05:22:53李耀深曹鑫段明王俊杰張彬李紅英侯思宇韓淵懷
關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化糜子

李耀深,曹鑫,段明,王俊杰,張彬,李紅英,侯思宇,2,韓淵懷,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷,030801; 2.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太谷,030801;3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原,030031)

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基于熒光檢測(cè)的糜子Genic-SSR PCR體系優(yōu)化

李耀深1,曹鑫1,段明1,王俊杰1,張彬1,李紅英1,侯思宇1,2,韓淵懷1,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷,030801; 2.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太谷,030801;3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原,030031)

摘要:[目的]本研究基于Fragment Analyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)系統(tǒng),以期建立一個(gè)最優(yōu)的糜子Genic-SSR分子標(biāo)記PCR反應(yīng)體系。[方法]試驗(yàn)采用L16(44)正交設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)了Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的不同濃度組合,并用Pragment Analyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。[結(jié)果]Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)效應(yīng)為:Mg2+>引物> dNTPs > Taq DNA聚合酶。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確立了糜子Genic-SSR熒光 PCR檢測(cè)體系的最佳反應(yīng)組分:20μL的反應(yīng)體系中包含0.2 mmol·L-1的dNTPs,0.2μmol·L-1引物,1.5 mmol·L-1的Mg2+和0.5 U的Taq DNA聚合酶。[結(jié)論]本研究建立了糜子的Genic-SSR分子標(biāo)記的最佳熒光PCR反應(yīng)體系,為糜子種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:糜子; Genic-SSR; 體系優(yōu)化; 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

糜子(Panicum miliaceumL.)是一年生禾本科黍?qū)僮魑?,民間又稱黍、稷和糜,主要種植在干旱半干旱的山區(qū),生育期短。糜子是我國(guó)主要米類作物之一,其脫殼之后稱為黃米[1]。黃米脂肪含量3.6%左右,蛋白質(zhì)含量12%左右,必需氨基酸構(gòu)成比例比較平衡,是很好的輔助食物[2]。同時(shí),黃米蛋白對(duì)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化和肝損傷有預(yù)防作用[3,4]。糜子籽粒中富含食用纖維,此外還含有多種維生素,如維生素E、維生素B6、B1、B2、β-胡蘿卜素等和豐富的多種礦物質(zhì)元素,如鈣、鎂、磷、鐵及鋅等[5]。在當(dāng)前食物多樣化的需求下,糜子豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值吸引了俄羅斯、印度、中國(guó)和美國(guó)等國(guó)家的科學(xué)家和市場(chǎng)的廣泛關(guān)注。盡管已有一些分子標(biāo)記已用于相關(guān)雜糧作物的遺傳種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性以及遺傳圖譜構(gòu)建,但是糜子的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)仍然嚴(yán)重滯后。目前,中國(guó)收集在冊(cè)的糜子品種資源已超8 500份[6],對(duì)這些品種的遺傳多樣性研究主要是通過(guò)表型鑒定[7~9],現(xiàn)今已不能滿足實(shí)踐需求。

近年來(lái),快速增長(zhǎng)的EST數(shù)據(jù)已成為SSR的重要來(lái)源,狗牙根、刺槐、菊花、光皮樺、荔枝、大白菜、蘿卜、馬鈴薯等多種植物都開(kāi)展了EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與利用[10~17]。Genic-SSR標(biāo)記是一種基于EST或者RNA序列的標(biāo)記系統(tǒng),其原理依托測(cè)序技術(shù),即EST文庫(kù)測(cè)序或目前較為先進(jìn)的高通量RNA-Seq技術(shù)獲得的植物、動(dòng)物或微生物的mRNA拼接序列而開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記。EST-SSR標(biāo)記大多重復(fù)基序位于基因編碼區(qū)5’端和3’端的非翻譯區(qū),重復(fù)序列的缺失和插入都可直接引起基因表達(dá)和功能的改變,可直接鑒定重要生物表型性狀所關(guān)聯(lián)的等位基因[18];而RNA-seq獲得的編碼序列較EST更長(zhǎng)(EST序列大多為3’端和5’端序列);基因注釋更為準(zhǔn)確。糜子屬于小雜糧作物,其關(guān)注程度相比主栽作物低,基因序列公開(kāi)報(bào)道較少,在一定程度上制約了糜子分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與利用。精確的Genic-SSR標(biāo)記具有信息量大、通用性好的特點(diǎn),更易分辨出不同基因型之間的親緣關(guān)系以及篩選關(guān)聯(lián)生物性狀的功能基因[19]。本文基于RNA-seq技術(shù),開(kāi)發(fā)相關(guān)的Genic-SSR標(biāo)記,除具有本身SSR標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)外,還具有高通量引物開(kāi)發(fā)、物種特異性強(qiáng)、條帶分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[20],不僅能從分子水平劃分糜子的群體結(jié)構(gòu),分析遺傳多樣性,而且可以直接發(fā)掘功能標(biāo)記基因,用于分子輔助選擇(Marker-assistedselection,MAS)和雜交育種[11]。但Genic-SSR分子標(biāo)記技術(shù)也是基于PCR擴(kuò)增技術(shù),其受到PCR反應(yīng)各種因素的影響,因此本試驗(yàn)采用L16(44)正交設(shè)計(jì),設(shè)置了不同濃度的TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物作為影響糜子Genic-SSR分子標(biāo)記PCR反應(yīng)中的4個(gè)主要因素篩選優(yōu)化組合。通過(guò)分析TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的效應(yīng),篩選出糜子Genic-SSR標(biāo)記的最佳PCR反應(yīng)體系。

目前SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶的分析方法主要是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,但其分辨率較毛細(xì)管電泳低,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本文采用了FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行糜子Genic-SSR位點(diǎn)檢測(cè),該系統(tǒng)基于熒光檢測(cè)技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展而來(lái)的新型DNA/RNA片段分離儀器,它采用敏感的嵌入染料以及強(qiáng)大的LED光源,避免了傳統(tǒng)方法中對(duì)熒光標(biāo)記引物的依賴,電驅(qū)動(dòng)原理對(duì)dsDNA片段和RNA樣品進(jìn)行分離并定性和定量檢測(cè),分辨率高、運(yùn)行速度快,具備高通量檢測(cè)優(yōu)勢(shì),大大減少分析所需時(shí)間[11]。為應(yīng)用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳結(jié)合Genic-SSR標(biāo)記技術(shù)研究糜子遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1試驗(yàn)材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的糜子品種為“雁黍7號(hào)”,取生長(zhǎng)18天的幼嫩葉片提取DNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。DNF-900-K0500試劑盒購(gòu)自AATI公司。DL500DNAMarker,Mg2+,dNTPs,TaqDNA聚合酶及其他常規(guī)試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取

糜子葉片總DNA的提取采用CTAB法,并經(jīng)去RNA,去蛋白處理。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量的完整性。經(jīng)過(guò)檢測(cè)DNA的OD值為1.91,DNA可用于Genic-SSR反應(yīng)。

1.2.2正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用L16(44)正交設(shè)計(jì)表[15],重復(fù)3次,對(duì)影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的Mg2+濃度,引物濃度,dNTPs和TaqDNA聚合酶濃度4個(gè)因素進(jìn)行了4個(gè)水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),模板DNA濃度為50mg·L-1。

1.2.3PCR擴(kuò)增程序

該反應(yīng)采用遞減PCR擴(kuò)增技術(shù),反應(yīng)體系為20μL,程序如下:

94 ℃預(yù)變性5min

表1糜子Genic-SSR分子標(biāo)記PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

Table1BroomcornmilletGenic-SSRmarkersPCRorthogonalexperimentaldesign

處理TreatmentsTaq酶/UTaqDNApolymeraseMg2+/mmol·L-1引物濃度/μmol·L-1PrimerConcentrationdNTPs/mmol·L-1A10.51.50.20.2A21.02.00.20.2A31.52.50.20.2A42.03.00.20.2A51.52.00.40.4A62.01.50.40.4A70.53.00.40.4A81.02.50.40.4A92.02.50.60.6A101.53.00.60.6A111.01.50.60.6A120.52.00.60.6A131.03.00.80.8A140.52.50.80.8A152.02.00.80.8A161.51.50.80.8

循環(huán)完成后72 ℃延伸5min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物首先在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè),然后用FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.2.4FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)

將PCR產(chǎn)物按AATI公司生產(chǎn)的DNF-900-K0500試劑盒步驟說(shuō)明加入到樣品槽中,按標(biāo)準(zhǔn)操作程序運(yùn)行FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)儀,分析結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

正交設(shè)計(jì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示,可以看出,以100ng·μL-1模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,各個(gè)反應(yīng)體系均可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。

圖1 “雁黍7號(hào)”Genic-SSR分子標(biāo)記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Electrophoresis detection by agarose gel of the PCR products from the Genic-SSR optimization in “Yanshu 7”

其中A3、A4和A13擴(kuò)增條帶不清晰,無(wú)有效PCR產(chǎn)物可供檢測(cè);A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A14、A15、A16均有清晰明顯的擴(kuò)增條帶,但是非特異性擴(kuò)增條帶較多,干擾了有效擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)。而A1、A2條帶都比較清晰,無(wú)非特異性擴(kuò)增,且A1相較于A2特異性更強(qiáng),因此在該反應(yīng)體系下擴(kuò)增結(jié)果較為可靠,可作為后續(xù)大規(guī)模擴(kuò)增反應(yīng)體系。

2.2FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果分析

FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖2所示,可以觀察出各反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物條帶深淺不同。本次研究主要篩選200~300bp的目標(biāo)產(chǎn)物,可以發(fā)現(xiàn)A2、A3、A5、A7、A9、A11、A12、A13、A15、A16條帶顏色較淺,說(shuō)明PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度比較低;A4、A6、A8、A10、A14條帶顏色比較深,但是雜帶比較多;A1條帶顏色深并且目標(biāo)區(qū)域特異性較高。

2.3PCR試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

在16個(gè)組合中,3個(gè)處理組合(A3、A4、A13)幾乎沒(méi)有擴(kuò)增條帶,其他組合均有明顯擴(kuò)增條帶,其中處理A1、A6、A7目標(biāo)條帶清晰,背景色相對(duì)較少,且條帶內(nèi)多態(tài)性較好。據(jù)此參考何正文等[22]和穆立薔等[23]的方法,進(jìn)行三次獨(dú)立打分,得分依次如下:16、15、6、9、7、14、13、12、2、3、8、11、4、1、5、10;16、10、5、7、8、15、14、13、3、4、11、12、1、2、6、9;16、7、4、9、11、15、14、10、1、2、8、13、3、6、5、12;將三次處理得分取平均數(shù),根據(jù)平均得分情況進(jìn)行直觀分析和方差分析。本次試驗(yàn)首先根據(jù)結(jié)果得分研究各個(gè)因素在各個(gè)水平的均值Ki,依值反映各個(gè)因素對(duì)反應(yīng)的影響,最后求出各個(gè)因素在各個(gè)水平的極值差R (R=Kmax-Kmin,Kmax為單個(gè)試驗(yàn)因素中的最大Ki,Kmin為單個(gè)試驗(yàn)因素中最小的Ki),R越大,說(shuō)明該因素對(duì)于試驗(yàn)影響越大[21]。由表2可以發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度的R值為5.57,說(shuō)明該因子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大;TaqDNA聚合酶R值為5.3,其影響最小。各個(gè)水平對(duì)于糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)影響依次為Mg2+>引物濃度>TaqDNA聚合酶=dNTPs濃度。

圖2 糜子Genic-SSR分子標(biāo)記PCR反應(yīng)體系優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖Fig.2 Capillary electrophoresis of optimization PCR products by Genic-SSR markers in broomcorn millet

2.4Genic-SSR PCR反應(yīng)正交設(shè)計(jì)方差分析

本研究利用正交設(shè)計(jì)助手軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響高于dNTPs的影響,而Mg2+對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大。其他因素影響的主次也與直觀分析基本一致的影響,表明試驗(yàn)結(jié)果誤差較小,其結(jié)果可信。

2.5Mg2+濃度對(duì)PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳的影響

經(jīng)上述分析,Mg2+對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大,從毛細(xì)管電泳的RFU值圖上也可反應(yīng)出此點(diǎn)。不同濃度的Mg2+反應(yīng)體系對(duì)PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳的相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)如圖3所示。RFU越大,表明目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度越大;RFU峰值(相對(duì)熒光強(qiáng)度)越多,說(shuō)明不同濃度的DNA片段越多。圖3中各條帶A1、A6、A11、A16分別代表1.5mmol·L-1、2mmol·L-1、2.5mmol·L-1、3mmol·L-1Mg2+濃度對(duì)應(yīng)各個(gè)反應(yīng)體系的RFU及目標(biāo)產(chǎn)物隨時(shí)間變化圖,可知1.5mmol·L-1Mg2+對(duì)應(yīng)條帶目標(biāo)產(chǎn)物RFU(目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度)最大,且波峰(不同濃度目標(biāo)產(chǎn)物)最少;2mmol·L-1Mg2+的條帶RFU有所降低,且雜帶有所增加;3mmol·L-1Mg2+的條帶RFU最小,且波峰較多,即雜帶較多。因此得出1.5mmol·L-1Mg2+為最佳反應(yīng)體系。

表2糜子Genic-SSR分子標(biāo)記PCR正交試驗(yàn)直觀分析表

Table2TableofBroomcornmilletGenic-SSRmarkersPCRorthogonalexperimentalvisualanalysis

統(tǒng)計(jì)因子StatisticsfactorTaq酶/UTaqDNApolymeraseMg2+/mmol·L-1引物濃度/μmol·L-1PrimerConcentrationdNTPs/mmol·L-1T145504040T234.136.748.848.8T332222626T430.327.721.621.6K113.0112.51010K28.539.1812.212.2K385.56.56.5K47.586.936.96.9R5.435.575.35.3

注:Ti為任一列上水平號(hào)為i(本試驗(yàn)中i=1,2,3,4)時(shí),所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)之和;Ki為任一列上因素取水平i時(shí)所得試驗(yàn)結(jié)果之和;Ki=Ti/s,s為任一列上各水平出現(xiàn)的次數(shù);R是極差

Note:Ti(i=1, 2,3,4inthisexperiment)isanyofacolumnsaretakenastheresultsofsumtothecorrespondingtest.Kiisthesumofthetestresultsobtainedwheniistakenasafactorinanyofacolumn.Ki=Ti/s,sforthenumberofappearstimesineverylevelforanyofacolumn.

表3糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)正交設(shè)計(jì)方差分析表

Table3TheorthogonaldesignanalysisofvariancetableofBroomcornmilletGenic-SSRPCRreaction

因素Factor偏差平方和Sumofsquare自由度DegreeoffreedomF值FValueF臨界值Fcritical-value引物濃度109.1930.8169.280dNTPs24.0830.1669.280Mg2+111.7430.7729.280Taq酶45.9230.3179.280誤差144.773

圖3 不同濃度Mg2+的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物RFU隨時(shí)間變化圖Fig.3 Changes of PCR amplification products (RFU) with time in different concentration of Mg2+   注:A1、A6、A11、A16分別代表1.5 mmol·L-1、2 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、3 mmol·L-1 Mg2+濃度對(duì)應(yīng)各個(gè)反應(yīng)體系的RFU(縱軸)及目標(biāo)產(chǎn)物隨時(shí)間變化(橫軸)Note: A1, A6, A11, A16 respectively represent 1.5 mmol·L-1, 2 mmol·L-1, 2.5 mmol·L-1 and 3 mmol·L-1 Mg2+ concentration corresponding to each of the reaction system of the target product for RFU (vertical axis) change with time (x-axis)

3討論

目前,SSR體系優(yōu)化試驗(yàn)主要采用單因素試驗(yàn)、完全試驗(yàn)或正交試驗(yàn)。完全隨機(jī)試驗(yàn)由于試驗(yàn)組合較大,工作量大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力而多選用單因素和正交試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)的一種組分發(fā)生變化,其他組分的濃度往往靠經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定,忽略各種組分的相互影響,難以確定最佳組合。而正交設(shè)計(jì)是利用一套規(guī)格化的正交表將各個(gè)因素、各個(gè)水平之間組合均勻搭配、合理安排,大大減少試驗(yàn)次數(shù),并提供較多的信息,是研究多因素、各個(gè)水平之間組合均勻搭配、合理安排,大大減少試驗(yàn)次數(shù),并提供較多的信息,可以又快又好的篩選最優(yōu)組合。

本試驗(yàn)采用了FragmentAnalyzer全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢測(cè),目前大部分SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)的擴(kuò)增條帶的分析方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,但其工作量大,相較于毛細(xì)管電泳分辨率低,所需時(shí)間較長(zhǎng)。毛細(xì)管電泳操作簡(jiǎn)單、工作量少、并且精確度較高、效率高。毛細(xì)管檢測(cè)可以通過(guò)熒光相應(yīng)強(qiáng)度與目標(biāo)產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳中與時(shí)間的關(guān)系反映目標(biāo)產(chǎn)物片段的大小以及目標(biāo)產(chǎn)物濃度的大小。全自動(dòng)毛細(xì)管電泳基于熒光檢測(cè)系統(tǒng),RFU(相對(duì)熒光強(qiáng)度越大),表明PCR目標(biāo)產(chǎn)物濃度越大;波峰越多,表明不同大小的目標(biāo)產(chǎn)物越多。通過(guò)圖三可以看出,隨著Mg2+濃度增大,目標(biāo)產(chǎn)物的RFU(熒光響應(yīng)強(qiáng)度)越來(lái)越小,表明目標(biāo)產(chǎn)物濃度越來(lái)越??;隨著時(shí)間邊長(zhǎng),波峰逐漸增多,非目標(biāo)產(chǎn)物片段變多。

試驗(yàn)采用試驗(yàn)室設(shè)計(jì)的Genic-SSR引物,通過(guò)正交設(shè)計(jì)對(duì)糜子Genic-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,得到糜子Genic-SSR最佳PCR反應(yīng)體系:20μL的反應(yīng)體系中有1.5mmol·L-1Mg2+、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2μMSSR引物和0.2mmol·L-1dNTPs。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證該反應(yīng)體系可以獲得清晰的多態(tài)性條帶,為今后糜子Genic-SSR反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

根據(jù)正交設(shè)計(jì)直觀分析和方差分析以及RFU隨時(shí)間的變化可以看出影響反應(yīng)的4個(gè)因素對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響有相輔相成的作用,但試驗(yàn)結(jié)果表明各個(gè)因素有主次之分,各個(gè)因素對(duì)于糜子Genic-SSRPCR反應(yīng)影響結(jié)果如下:Mg2+>引物濃度>dNTPs>TaqDNA聚合酶。Mg2+通過(guò)影響引物與模板的結(jié)合效率、產(chǎn)物特異性及引物二聚體的形成,繼而成為影響PCR產(chǎn)量和擴(kuò)增特異性的最重要因素。此外,引物濃度作為影響PCR反應(yīng)的另一個(gè)重要因素,濃度過(guò)高容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增,使得引物二聚體含量增加且還易引起堿基錯(cuò)配。引物濃度過(guò)低,則易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象并導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量下降[19]。在本次試驗(yàn)中模板DNA濃度為100mg·L-1的固定濃度,對(duì)于PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性幾乎無(wú)影響。DNA純度對(duì)于Genic-SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增有較大的影響,本次試驗(yàn)采用的DNA經(jīng)去RNA、去蛋白處理,純度較高(OD值為1.91)有效的提高了瓊脂糖凝膠和毛細(xì)管電泳的效果。

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(編輯:邢國(guó)芳)

TheoptimizationofPCRreactionsystemforGenic-SSRanalysisinbroomcornmillet

LiYaoshen1,CaoXin1,DuanMing1,WangJunjie1,ZhangBin1,LiHongying1,HouSiyu1,2,HanYuanhuai1,2,3*

(1.College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2.Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops,Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 3.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China)

Abstract:[Objective] The fluorescent PCR reaction system for Genic-SSR analysis was optimized by using the Fragment Analyzer Automatic Capillary Electrophoresis detection system in broomcorn millet. [Methods]Optimization was based on L16 (44) orthogonal design, with different concentrations of Taq DNA Polymerase, Mg2+, dNTPs and primers. [Results] The order of the effects for the system was: Mg2+>primer>dNTPs>Taq DNA Polymerase. Through the orthogonal experimental design, a 20 μL reaction system was established, which contained a 0.2 mol·L-1dNTPs, 0.2 μmmol·L-1SSR primer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, and 0.5 U Taq DNA Polymerase. [Conclusion]This optimal PCR reaction system could be used for genetic clustering analysis of germplasm with Genic-SSR markers and for further development of molecular markers for marker-assisted breeding in broomcorn millet.

Key words:Broomcorn millet; Genic-SSR; PCR reaction system; Orthogonal design

收稿日期:2016-01-29 修回日期:2016-03-22

作者簡(jiǎn)介:李耀深(1991-),男(漢),廣西貴港人,碩士研究生,研究方向:糜子遺傳多樣性 *通訊作者:韓淵懷,教授,博士生導(dǎo)師。Tel:03546287239;E-mail:swgctd@163.com

基金項(xiàng)目:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新育種基金 (2013-2016);山西特色植物基因資源開(kāi)發(fā)與利用平臺(tái)項(xiàng)目(2012091004-0103)

中圖分類號(hào):S516

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1671-8151(2016)07-0477-06

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