張　娜，藍(lán)瑞隆，鐘光賢

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院 血液科，福建省血液病研究所，福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，福建 福州 350005)

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MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表達(dá)及意義

張娜1，藍(lán)瑞隆2，鐘光賢3

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院 血液科，福建省血液病研究所，福建省血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350005；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，福建 福州 350005)

[摘要]目的檢測單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(MCT1)在鼻咽癌病人和正常人外周血髓系抑制性細(xì)胞(MDSC)中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法隨機(jī)收集經(jīng)病理確診的鼻咽癌病人和正常人外周血各10例，紅細(xì)胞裂解液處理后，采用BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀分選出MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)，q-PCR檢測比較兩組MCT1 mRNA水平的差異。結(jié)果鼻咽癌病人外周血中MDSC的比例(19.77±4.77)%顯著高于正常人(0.84±0.18)%，P<0.001；且前者M(jìn)CT1 mRNA水平(4.05±0.56)為后者(2.15±0.33)的1.88倍，差異有顯著性意義(P<0.01)。結(jié)論鼻咽癌病人外周血中的MDSC可能是憑借其在數(shù)量上的優(yōu)勢及能量代謝上的特性，更好地發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]MCT1; MDSC; 鼻咽癌；能量代謝；免疫抑制

[引用本文]張娜，藍(lán)瑞隆，鐘光賢.MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表達(dá)及意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(2)：114-117.

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，有較強(qiáng)的人種和地域分布特點(diǎn)，多發(fā)于東亞和非洲，中國的南部地區(qū)，包括廣東、福建、湖南等省為高發(fā)區(qū)[1-3]。放射治療是鼻咽癌治療的首選治療方法[4]，也常輔化學(xué)藥物治療，其5年生存率為80%左右。導(dǎo)致生存率無法繼續(xù)提升的原因除了部分患者出現(xiàn)放化療抵抗外，免疫抑制性細(xì)胞如MDSC、Treg等介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸也是不容忽視的重要原因。

髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是由骨髓中共同髓系祖細(xì)胞(CMP)分化發(fā)育而來，缺乏成熟粒細(xì)胞、Mφ或樹突狀細(xì)胞的特殊細(xì)胞表面標(biāo)志，卻具有粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的形態(tài)[5-7]，在人類，MDSC最常見的細(xì)胞表型為CD14-CD11b+，或表達(dá)髓系共同標(biāo)志CD33，但不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子HLA-DR及成熟的髓系或淋巴系標(biāo)記。該群細(xì)胞在許多腫瘤(如乳腺癌、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌等)微環(huán)境中大量擴(kuò)增，可以通過表達(dá)高水平精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)[8]、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)[9]和細(xì)胞-細(xì)胞間接觸[10]等多種作用方式有效抑制機(jī)體免疫應(yīng)答。既能夠抑制NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)，又能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

細(xì)胞功能的發(fā)揮伴隨著不同的能量代謝水平，能量代謝水平的變化直接影響細(xì)胞的生命狀態(tài)(如正常分裂、分化或者惡性增殖等)，對細(xì)胞的生存和穩(wěn)態(tài)的維持起著核心作用[11]。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(monocarboxylate transporter 1，MCT1) 是能量代謝中的重要分子，它是一種細(xì)胞跨膜蛋白，可將乳酸從胞外攝入到胞內(nèi)從而降低機(jī)體的乳酸水平。MDSC在許多腫瘤微環(huán)境中大量存在，其能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平也必定在其功能維持中起著重要作用。目前，MDSC在鼻咽癌病人中的相關(guān)研究及MCT1是否對MDCS的功能發(fā)揮某種作用鮮見報道。本研究通過檢測正常人和鼻咽癌病人外周血中MDSC的含量，并檢測能量代謝重要分子MCT1的mRNA水平，初步探討MCT1對MDSC免疫抑制功能發(fā)揮的作用。

1材料和方法

1.1主要試劑

RNA提取試劑盒(Promega)；real-time PCR檢測試劑盒(Promega)；紅細(xì)胞裂解液(碧云天)；FITC-anti-human CD11b抗體(Cat. # 301330)、PE-anti-human CD33抗體(Cat. # 366608)、APC-anti-human HLA-DR抗體(Cat. # 361610)均購自Biolegend。

1.2方法

隨機(jī)收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科2014年9月至11月間10例鼻咽癌病人(中位年齡為41.5歲，經(jīng)MRI規(guī)范掃描并行病理確診，采血前均未接受放化療)的外周血作為實(shí)驗(yàn)組(NPC組)；隨機(jī)收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心2014年11月的10例正常人(中位年齡為39.7歲，近5年無重大疾病且近1個月無感冒發(fā)燒等身體不適)的外周血為作對照組。男女比例均為1∶1。

紅細(xì)胞裂解：加入3～5倍細(xì)胞體積的1×紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min后400～500 g離心5 min，棄上清。

MDSC分選：按照說明書用PBS或者生理鹽水稀釋FITC-anti-human CD11b、PE-anti-human CD33以及APC-anti-human HLA-DR抗體，室溫標(biāo)記40 min后生理鹽水重懸，離心棄上清后按約1.0×107/mL細(xì)胞密度加入一定體積的生理鹽水重懸細(xì)胞，分選出MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)細(xì)胞亞群。

q-PCR檢測MCT1 mRNA水平：按照試劑盒說明書提取MDSC總RNA，q-PCR檢測鼻咽癌病人和正常人MDSC中MCT1的mRNA水平差異。MCT1(擴(kuò)增長度為132 bp)引物序列為：sense-5′-GTGGCTCAGCTCCGTATTGT-3′；antisense-5′- GAGCCGACCTAAAAGTGGTG-3′；相時擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH，引物序列為：sense-5′- ATGACAT-CAAGAAGGTGGTG-3′，antisense-5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)，同時采用2-ΔΔCt法計算各樣本的MCT1 mRNA相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1流式分選結(jié)果

鼻咽癌病人和正常人外周血MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)分選情況見圖1。鼻咽癌病人外周血中MDSC的比例為(19.77±4.77)%，是正常人(0.84±0.18)%的23.55倍，差異有顯著性意義，P<0.001。見圖2。

2.2鼻咽癌病人和正常人外周血MDSC中MCT1 mRNA水平比較

用管家基因GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，q-PCR結(jié)果表明：鼻咽癌病人外周血MDSC中MCT1 mRNA水平(4.05±0.56)為正常人(2.15±0.33)的1.88倍，兩組間差異有顯著性意義，P<0.01。見圖3。

圖1　流式分選人外周血MDSC(CD11b+CD33+ HLA-DR- )Fig 1 PBMC MDSC(CD11b+CD33+ HLA-DR- ) sorted by FACS

圖2　正常人和鼻咽癌病人MDSC占外周血單個核細(xì)胞的比例Fig 2 MDSC ratio in PBMC of healthy donors and NPC patients*與正常人比較，P<0.001

圖3　q-PCR檢測人外周血MDSC中MCT mRNA的相對表達(dá)量Fig 3 MCT mRNA level of MDSC by q-PCR*與正常人比較，P<0.01

3討論

免疫抑制性細(xì)胞MDSC能夠下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)。已有許多研究表明，MDSC的清除能夠顯著提高抗腫瘤免疫反應(yīng)。MDSC在腫瘤分泌相關(guān)因子包括IL-6、GM-CSF、IL-1β的招募下，從骨髓進(jìn)入外周血并最終聚集于腫瘤的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，通過表達(dá)arginase I、iNOS以及產(chǎn)生免疫抑制因子如ROS、IL-6、 IL-10、TGFβ1進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。大量研究已經(jīng)證實(shí)，MDSC在許多腫瘤病人外周血和腫瘤微環(huán)境中大量存在，并且與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。本研究流式分選結(jié)果表明，鼻咽癌病人外周血中的MDSC比例顯著高于正常人，這與其他許多腫瘤中的報道一致。而大量的MDSC為免疫抑制功能的發(fā)揮提供了重要條件。

在能量代謝旺盛的腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞本身的迅速增殖消耗了大量的能源物質(zhì)(如葡萄糖)，故可供MDSC利用的能源物質(zhì)比較有限，這對大量浸潤于腫瘤微環(huán)境中的MDSC是極為不利的。腫瘤細(xì)胞通過無氧糖酵解快速獲取能量以滿足自身迅速增殖的需要，但也將大量地排出能量代謝中間產(chǎn)物乳酸，使得腫瘤局部微環(huán)境大量乳酸堆積，不利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明，氧氣充足區(qū)的腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過MCT1利用腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝所產(chǎn)生的乳酸[11]。而在腫瘤微環(huán)境中大量存在的MDSC是否也能夠利用其中的代謝中間產(chǎn)物乳酸則鮮見報道。本研究結(jié)果表明，MCT1 mRNA在鼻咽癌病人MDSC中的表達(dá)顯著高于正常人，而高表達(dá)的MCT1分子無疑為MDSC打開了一個重要的能量分子通道，能夠?qū)⒛[瘤微環(huán)境中的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，滿足MDSC的耗能需求。腫瘤微環(huán)境中乳酸濃度的降低為腫瘤的存活和轉(zhuǎn)移提供了有利條件?？梢酝茰y，MDSC正是以這種“能量寄生”的方式，在緩解腫瘤微環(huán)境乳酸堆積的同時也為獲得了大量的能源物質(zhì)，這為其自身免疫抑制功能的發(fā)揮提供了重要條件。

綜上，鼻咽癌病人外周血中的MDSC不但在數(shù)量上顯著高于正常人，而且其能量代謝的重要分子MCT1也顯著高于正常人，后者為其在能源物質(zhì)相對匱乏的腫瘤微環(huán)境中以乳酸為能量來源提供了前提，這將為以MCT1為靶點(diǎn)阻礙MDSC的免疫抑制功能發(fā)揮提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。也許鼻咽癌病人中的MDSC正是憑借其在數(shù)量及能量代謝上的特殊優(yōu)勢，更好地發(fā)揮了其免疫抑制效應(yīng)，而這其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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Expression and significance of MCT1 in MDSC from peripheral blood of nasopharyngeal carcinoma patients

ZHANG Na1, LAN Rui-long2, ZHONG Guang-xian3

(1.DepartmentofHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital，F(xiàn)ujianInsituteofHematology，F(xiàn)ujianProvincialKeyLaboratoryofHematology,Fuzhou350001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China； 3.DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China)

[Abstract]Objective To investigate MCT1 expression of MDSC in peripheral blood obtained from nasopharyngeal carcinoma (NPC) patients and healthy donors, and discuss its clinical significance. Methods Peripheral blood samples were obtained randomly from 10 NPC patients and 10 healthy donors, processed by RBC lysates and MDSC (CD11b+CD33+HLA-DR-) within them were sorted by BD FACSAriaⅢ. qRT-PCR were adopt to determine the MCT1 mRNA levels, t-test was used to evaluate the significance between groups. Results The MDSC ratio of NPC patients (19.77±4.77)% was significant higher than that of healthy donors (0.84±0.18)% (P<0.001). MCT1 mRNA level (4.05±0.56) of MDSC obtained from NPC patients was significantly higher than that of healthy donors (2.15±0.33) (P<0.01). Conclusion MDSC within peripheral blood of NPC patients could play an immunosuppressive effect by its superiority in number and energy metabolism property.

[Key words]MCT1; MDSC; nasopharyngeal carcinoma; energy metabolism; immunosuppression

基金項目:福建省自然科學(xué)基金項目(2014J05088)

作者簡介:張 娜(1986-)，女，吉林松原人，檢驗(yàn)技師。E-mail：zhanglin770@126.com

doi:論著10.11724/jdmu.2016.02.03

[中圖分類號]R739.62; R739.63

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)02-0114-04

(收稿日期:2015-12-11；修回日期：2016-03-18)