張楠楠　白康　陳輝等

摘要： 為了研究外源瘦素對蛋雞的能量代謝調(diào)控、瘦素受體基因表達的影響，選用25羽30周齡、體況相似的海蘭褐商品蛋雞，隨機分成5組，每組5羽：Ⅰ組為自由攝食組；Ⅱ組為禁食對照組，注射瘦素稀釋液（0 75%PBS-BSA）；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為試驗注射組，在第8至第10天注射瘦素，注射水平分別為50、200、400 μg/（kg·d）。結(jié)果表明：與Ⅰ、Ⅱ組相比，試驗Ⅴ組采食量顯著下降（P<0 05），試驗Ⅲ至Ⅴ組的采食量分別為Ⅱ組的92 86%、89 89%、75 46%；Ⅱ組體質(zhì)量相對于Ⅰ組極顯著下降（P<0 01），相對于Ⅲ、Ⅳ組顯著下降（P<0 05），其余各組間均無明顯差異，其中試驗Ⅱ至Ⅴ組蛋雞的體質(zhì)量分別為Ⅰ組體質(zhì)量的92 25%、99 18%、98 53%、95 30%；與Ⅴ組相比，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組的腹脂率差異顯著（P<0 05），分別僅為Ⅴ組的58 98%、45 84%、58 71%，其余各組間均無明顯差異；與Ⅰ、Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組葡萄糖含量差異顯著（P<0 05），分別為Ⅱ組的72 64%、61 15%、59 59%，而試驗Ⅱ組與Ⅰ組無顯著差異；各組甘油三酯含量無明顯變化，在各組之間差異不顯著；試驗Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟OB-R基因表達量分別為Ⅱ組的35 19%、617%、741%、3 09%，試驗各組之間OB-R基因表達量差異不顯著。綜上所述，瘦素對蛋雞食欲具有抑作用，瘦素使蛋雞采食量下降，表現(xiàn)為體質(zhì)量降低，葡萄糖、甘油三酯含量、肝臟OB-R基因表達量隨著瘦素注射量的增加呈下降的趨勢。

關(guān)鍵詞： 外源性瘦素；跖部靜脈注射；蛋雞；注射水平；能量代謝；OB-R基因

中圖分類號：S831 915 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0198-04

瘦素（leptin，LEP），是一種由肥胖基因（obese gene，ob基因） 編碼、特定mRNA翻譯，經(jīng)過加工修飾而成的蛋白質(zhì)類產(chǎn)物，1994年由Zhang等首次發(fā)現(xiàn) [1]。瘦素通過結(jié)合瘦素受體發(fā)揮其廣泛的生理作用，瘦素具有抑制食欲，調(diào)節(jié)能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌、生長、生殖、免疫反應(yīng)等多種功能。脂肪是禽類機體重要的儲存與提供能量的物質(zhì)之一，蛋雞的脂肪主要集中在腹部與肌胃上，而肝臟被認為是雞脂質(zhì)合成的最主要場所 [2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素發(fā)揮其促進蛋雞能量代謝等生物功能需要OB-R（瘦素受體）的介導(dǎo)，雞OB-R在脂肪、肝臟中都有一定的表達 [5]。目前，瘦素在蛋雞上的相關(guān)研究依然較少，本試驗通過對蛋雞注射外源瘦素，觀察外源瘦素對蛋雞能量代謝及腹脂、肝臟OB-R基因表達的影響，以期為進一步研究外源瘦素在蛋雞上的相關(guān)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 試驗材料

試驗用雞為30周齡、體況相似的海蘭褐商品蛋雞。瘦素：粉狀，純度≥97%，批號：L3772-1MG，美國Sigma公司。

1 2 試驗設(shè)計

本試驗選擇20羽30周齡、體質(zhì)量相近[（1 560 ±114） g]的蛋雞，隨機分為5組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，每組5羽雞。預(yù)試期1周，第8至第13天為試驗期，試驗期每天8：00注射組通過跖部靜脈注射經(jīng)0 75%PBS-BSA稀釋液稀釋后的商品化重組小鼠瘦素，注射水平分別為50、200、400 μg/（kg·d），對照組注射稀釋液。具體試驗處理方案見表1。

試驗飼糧為玉米-豆粕型飼糧，按照我國NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》進行配制，其營養(yǎng)組成和營養(yǎng)水平見表2。

1 3 樣品采集與制備

試驗期以d為單位，稱取每羽雞體質(zhì)量。試驗期的第10天10：00通過跖部采集血液至肝素鈉真空采血管中，3 000 r/min 離心10 min，取血漿，-20 ℃保存。

試驗結(jié)束后，于早晨對所有蛋雞采取頸靜脈放血宰殺，迅速剖開腹腔，在無RNA降解酶的環(huán)境下，取黃豆粒大小的肝臟與脂肪組織包裹于高溫滅菌的鋁箔紙中，放于標(biāo)記好的紗布袋中，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1 4 指標(biāo)測定

1 4 1 體質(zhì)量、腹脂沉積率的測定 試驗期以天（d）為單位，通過稱取每羽雞的體質(zhì)量記錄采食量。

腹脂率：剝離將屠宰蛋雞的腹脂（包括肌胃上的脂肪），然后在電子天平上稱質(zhì)量，計算腹脂率。

1 4 2 血液指標(biāo)的測定 甘油三酯（TG）含量的測定采用GPO-PAP法，試劑盒購自中生北控生物科技有限公司；血糖（GLU）含量測定采用葡萄糖氧化酶法進行，試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑公司。

1 4 3 腹脂、肝臟中OB-R mRNA表達水平的測定

1 4 3 1 總RNA的提取和檢測 取30～50 mg組織，用 E Z N A TM Total RNA Kit II提取試劑盒（OMEGA）進行總RNA提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用紫外吸收測定法測定RNA的 D260 nm、D280 nm、RNA樣本的質(zhì)量濃度、純度（D260 nm/D280 nm）。

1 4 3 2 反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA及cDNA第1鏈的檢測 （1）DNA第1鏈的制備。根據(jù)所測RNA質(zhì)量濃度來調(diào)整RNA體積，使各個樣品RNA濃度一致，保證反轉(zhuǎn)錄體系中所加的RNA量相同。用TransScriptⅡFirst-Stand cDNA合成試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。25 μL反應(yīng)體系為：5 μL RNA（1 μg/μL）、1 25 μL Oligo（dT18）、12 5 μL 2×ES Reaction Mix、1 25 μL EasyscriptTM Ri/RT Enzyme Mix、5 μL RNase-free Water。將以上組分輕輕混勻，于42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min，將得到的cDNA于-20 ℃保存。

（2）cDNA第1鏈的檢測。用持家基因β-actin對所得cDNA進行檢測，β-actin的引物對cDNA擴增片段長度為110 bp，而基因組擴增片段長度為328 bp，若RNA樣品中有DNA的污染，則cDNA檢測會擴增出105、328 bp 2個片段。

1 4 3 3 引物設(shè)計與合成 選擇β-肌動蛋白（β-actin）為參比基因，在GenBank中查找OB-R、β-actin的基因序列，應(yīng)用Primer 5、Oligo 6 0引物設(shè)計軟件，根據(jù)已知的序列進行引物設(shè)計（表3），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以持家基因β-actin為內(nèi)參、OB-R為目的基因，以合成的cDNA為模板，按照普通PCR程序，初步擴增檢測所合成引物的特異性。

1 4 3 4 PCR反應(yīng) 用Easy-TaqDNA Polymerase試劑盒對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，15 μL反應(yīng)體系為：7 5 μLPCR Mix、各0 2 μL目的基因上下游引物、1 2 μL cDNA、5 9 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1 4 3 5 PCR產(chǎn)物的回收及克隆測序 瓊脂糖凝膠電泳分離：在紫外燈下割取目的片段，用DNA回收試劑盒純化，將回收的DNA片段與載體連接，用E coli DH5α感受態(tài)細胞進行克隆，挑取陽性克隆并用PCR鑒定后，送到華大基因有限公司進行測序。

1 4 3 6 實時熒光定量PCR反應(yīng) 采用 TransStart Taq DNA Polymerase 熒光定量試劑盒對樣品的cDNA、內(nèi)參基因、陰性對照進行擴增，整個反應(yīng)在ABI 7 500序列擴增儀中進行。15 μL反應(yīng)體系為：1 2 μL cDNA、各0 2 μL目的基因上、下游引物、7 5 μSYBR Real Master Mix、5 9 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃12 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。72～95 ℃，每0 2 ℃讀板1次，1 s/次，每個樣本重復(fù)3次，采用ΔΔCT算法計算樣品中目標(biāo)基因相對與持家基因的表達量，最后取平均值。CT指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個樣本的相對表達量等于目的基因的表達量平均值除以參比基因的表達量平均值，即獲得目的基因的1個相對比值，用以表示其mRNA 表達水平。

1 5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS Statistics 17 0軟件ANVON模塊進行方差分析，各組間的平均值采用LSD法進行差異顯著性檢驗，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX- 5]±s）表示，P<0 05為差異顯著，P<0 01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2 1 外源性重組小鼠瘦素對蛋雞能量代謝的影響

2 1 1 外源瘦素對蛋雞采食量、體質(zhì)量、腹脂率的影響 由表4可以看出，外源瘦素對蛋雞采食量的影響表現(xiàn)為：與Ⅰ、Ⅱ組相比，Ⅴ組采食量顯著下降（P<0 05），Ⅲ至Ⅴ組采食量分別為Ⅱ組的92 86%、89 89%、75 46%；與Ⅰ組相比，Ⅱ至Ⅳ組采食量差異不顯著。對蛋雞體質(zhì)量的影響表現(xiàn)為：所有的禁食組在禁食2 d之后出現(xiàn)蛋雞體質(zhì)量顯著下降的現(xiàn)象，Ⅱ組與Ⅰ組相比下降極顯著（P<0 01），與Ⅲ、Ⅳ組相比下降顯著（P<0 05），其余各組間均無明顯差異，其中Ⅱ～Ⅴ組蛋雞體質(zhì)量分別為Ⅰ組的92 25%、99 18%、98 53%、9530%。對蛋雞腹脂率影響表現(xiàn)為：與Ⅴ組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組腹脂率差異顯著（P<0 05），分別僅為Ⅴ組的58 98%、4584%、58 71%，其余各組間均無明顯差異。

2 1 2 外源瘦素對血漿中葡萄糖、甘油三酯含量的影響由

2 2 外源瘦素對蛋雞OB-R基因定量表達的影響

2 2 1 總RNA的提取和RT-PCR擴增 由圖1可以看出，各組總RNA提取后在瓊脂糖凝膠電泳圖上顯示出2條清晰的條帶，分別為28S、18S rRNA。經(jīng)生物學(xué)軟件分析，28S、18S rRNA條帶的亮度比值>1 5，表明總RNA無降解。用分光光度計測定RNA濃度結(jié)果表明，所有樣品的總RNA的 D260 nm/D280 nm 均在2 0左右，表明無蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。確定提取的RNA質(zhì)量完好后，可用于后續(xù)的cDNA的合成及實時熒光定量PCR分析。

cDNA質(zhì)量檢測：以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用 β-actin 引物進行PCR擴增反應(yīng)，所得片段長度為110 bp，若RNA中存在污染，則可得到1條長度為328 bp的擴增引物。所有cDNA樣品經(jīng)PCR擴增反應(yīng)后，所得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中均顯示出長度為110 bp的單一條帶（圖2），未見長度為328 bp的擴增產(chǎn)物，表明RNA中無DNA污染，符合PCR反應(yīng)的要求，可以進行后續(xù)試驗。

2 2 2 外源性重組小鼠瘦素對蛋雞OB-R基因定量表達的影響 由表6可見，試驗各組之間腹脂OB-R基因表達量及肝[CM（25]臟OB-R基因的表達量差異均不顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組腹脂OB-R基因表達量分別為自由攝食組的49 37%、 1013%、27 85%、29 11%；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟OB-R基因的表達量分別為禁食對照組的35 19%、6 17%、7 41%、3 09%。

3 討論

3 1 外源性瘦素對蛋雞采食量、體質(zhì)量、腹脂率的影響

體質(zhì)量、體內(nèi)脂肪沉積情況是衡量家禽生長發(fā)育狀況的關(guān)鍵指標(biāo)，體質(zhì)量、脂肪質(zhì)量的過高或過低都會對蛋雞的生產(chǎn)性能造成不利影響 [6]。王淑紅等研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞產(chǎn)蛋后期體質(zhì)量對產(chǎn)蛋量有極顯著影響，體質(zhì)量大于2 102 g時，蛋雞的生產(chǎn)性能較差 [7]。Cassy等研究認為，瘦素對雞的采食量、體質(zhì)量的調(diào)控與雞的年齡和品系有關(guān) [8]。蛋雞采食量也會直接或間接影響體質(zhì)量、脂肪的沉積量，瘦素具有降低采食量的作用，Cassy等研究報道，通過腹腔內(nèi)注射重組雞瘦素[1 mg/（kg·d）]使56日齡蛋雞攝食量顯著降低38%，9日齡蛋雞攝食量顯著降低15% [8]。宋岳強研究表明，在連續(xù) 2 d 對家鴨進行靜脈注射外源性瘦素后發(fā)現(xiàn)，瘦素可以降低家鴨體質(zhì)量 [9]。本試驗中，2 d的禁食引起所有禁食組的蛋雞體質(zhì)量、腹脂率下降，經(jīng)過重新提供水料，隨著外源性重組小鼠瘦素水平的升高，蛋雞體質(zhì)量卻還一直呈現(xiàn)下降趨勢，與宋岳強的研究結(jié)果 [9]基本一致，但是蛋雞的腹脂率總體呈現(xiàn)增加的趨勢。試驗Ⅴ組腹脂率與試驗Ⅱ組相比顯著增加（P<0 05），由于瘦素有抑制脂肪沉積的作用，可以推斷短期注射外源性瘦素對脂肪的沉積可能無明顯影響，而對蛋雞體質(zhì)量影響較為顯著。

3 2 外源性瘦素對血漿中葡萄糖、甘油三酯含量的影響

瘦素通過與外周組織受體結(jié)合而影響一系列機體代謝過程，糖、脂肪提供動物生命活動所需的能量。葡萄糖在動物機體糖代謝過程中起著關(guān)鍵作用，是機體主要的供能物質(zhì)，其含量高低與生產(chǎn)性能的發(fā)揮關(guān)系密切，而甘油三酯是脂類代謝過程中的1種重要中間代謝產(chǎn)物，能反映機體脂肪合成與分解的狀況。瘦素與糖、脂代謝有著復(fù)雜關(guān)系，瘦素缺乏可能會導(dǎo)致肥胖與糖尿病的發(fā)生 [10]。Cheung等給予小鼠注射重組瘦素后，發(fā)現(xiàn)小鼠代謝效率、能量消耗增加，葡萄糖敏感神經(jīng)元受到抑制 [11]。有研究在小鼠肝臟中灌注高濃度的瘦素發(fā)現(xiàn)，磷化酶活性、肝糖原分解受到抑制，肝糖原儲存增加，葡萄糖濃度降低 [12]，說明瘦素能通過促進能量消耗并抑制糖異生對機體代謝進行調(diào)控。瘦素能夠抑制脂肪的沉積，促進脂肪的水解，增加能量消耗，可直接作用于胰島細胞，對糖、脂代謝進行調(diào)控 [13]。Shimabukuro等用瘦素處理離體的胰島組織，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)自由脂肪酸的氧化速度升高，甘油三酯含量降低 [14]。Bado等研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜上皮中存在著瘦素，許多短型的Ob-R在空腸、回腸表達，抑制腸道對糖的吸收，降低載脂蛋白量，從而減少乳糜顆粒中的甘油三酯 [15]。本試驗中，Ⅲ至Ⅴ組蛋雞的葡萄糖、甘油三酯與禁食對照組相比均下降了，Ⅲ、Ⅳ組葡萄糖含量與對照組相比顯著下降（P<0 05），各組間甘油三酯含量差異不顯著。試驗中蛋雞血液中葡萄糖、甘油三酯水平與瘦素注射水平呈負相關(guān)，與Aiston等研究結(jié)果 [16]基本相符，而由瘦素導(dǎo)致的血液中葡萄糖、甘油三酯水平的下降也可能是蛋雞體質(zhì)量下降的原因之一。但是有關(guān)瘦素對糖、脂代謝的具體調(diào)節(jié)機制尚未清晰，仍有待研究。

3 3 外源性瘦素對蛋雞肝臟OB-R基因定量表達的影響

外源性瘦素主要通過OB-Rb來發(fā)揮其生物學(xué)功能，動物生長發(fā)育到一定階段后，瘦素作為動物繁殖系統(tǒng)的一個重要信號，使體內(nèi)脂肪的含量持續(xù)升高，脂肪是動物機體貯存能量的重要物質(zhì)，在動物能量代謝中發(fā)揮著重要的作用，瘦素可作為抑制性信號，對脂肪的沉積起負調(diào)節(jié)作用 [17]。蛋雞的脂肪主要集中在腹部與肌胃上，腹脂是家禽體內(nèi)蓄積脂肪的主要部位，雞腹脂質(zhì)量約占體脂質(zhì)量的22%，而腹脂的合成與分解受肝臟的調(diào)控，肝臟在機體能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。但是蛋雞過多的腹脂會影響其生產(chǎn)性能，因此可以通過肌肉注射外源激素來抑制脂肪的沉積，瘦素發(fā)揮其促進蛋雞能量代謝等生物功能須要OB-R的介導(dǎo)。相關(guān)試驗證實，OB-R基因在動物肝臟和腹脂中均有表達，在肉雞、火雞上發(fā)現(xiàn)的受體中，只有長型受體（OB-Rb）被分離鑒定，主要分布于腦部、卵巢，在肝臟、腎臟、小腸中也有分布 [5]，肝臟中OB-R基因表達量較大，有利于借助瘦素發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中的瘦素mRNA水平與胖瘦程度呈正相關(guān) [18]。宋岳強研究報道，禁食可抑制家鴨卵巢瘦素受體mRNA的表達，注射外源性瘦素可以促進卵巢瘦素受體mRNA的表達 [9]；Cassy等研究表明，對蛋雞進行短期禁食同樣能抑制雞卵巢OB-R基因表達 [8]。在本試驗中，2 d的禁食使肝臟中OB-R mRNA基因表達量有下降的趨勢，差異不顯著，瘦素發(fā)揮其功能則有可能受到一定程度的限制，與宋岳強研究結(jié)果 [9]不盡一致，與Cassy等的研究結(jié)論 [8]類似，具體原因需進一步深入研究。外源性瘦素對肝臟中OB-R基因表達的影響不顯著，瘦素有可能不通過調(diào)整OB-R基因而通過別的途徑來影響脂肪沉積。

4 結(jié)論

瘦素對蛋雞食欲具有抑作用，使蛋雞采食量下降，表現(xiàn)為體質(zhì)量降低，葡萄糖、甘油三酯含量以及肝臟OB-R基因表達量隨著瘦素注射量的增加呈下降的趨勢。本試驗中，400 μg/（kg·d） 注射水平對蛋雞的影響較為明顯，但是外源性瘦素對腹脂、肝臟中OB-R基因表達的影響不顯著，瘦素有可能不通過調(diào)整OB-R基因來影響脂肪沉積。

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