張　萌，邊志剛，何　平*

葫蘆素B對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及凋亡的影響

張萌a，邊志剛b，何平a*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院a.干診科，b.鼻科，沈陽 110004

[摘要]目的探討葫蘆素B對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其作用的分子機制。方法體外培養(yǎng)BGC-823細(xì)胞，MTT法觀察葫蘆素B對細(xì)胞增殖的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，采用分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9的活性，采用Western blot方法檢測葫蘆素B對Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞的增殖有抑制作用，且此作用呈劑量和時間依賴性；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，葫蘆素B誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性。葫蘆素B處理后Caspase-3、Caspase-9活性升高，細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bak的表達(dá)增加。結(jié)論葫蘆素B可以抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]葫蘆素B；胃癌；凋亡

0引言

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)報道，2008年全球胃癌患者的5年生存率約為20%[1]，2010年胃癌成為全球第2大腫瘤致死因素[2]，嚴(yán)重威脅人類健康。由于胃癌早期的臨床癥狀不明顯，約2/3的患者就診時已為局部晚期或伴有轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)治療的時機，化療成為主要的治療手段。目前用于治療胃癌的化療藥物種類很多，但聯(lián)合化療方案并沒有顯著提高治療有效率，沒有達(dá)到使患者總生存獲益的目的，而化療藥物本身的毒副作用明顯，使患者難以耐受。因此，探索新的治療藥物對胃癌的治療具有重要意義。

葫蘆素是從葫蘆科植物甜瓜蒂及其他科屬多種植物中提取到的一類具有苦味或甜味的四環(huán)三萜類化合物,具有抗炎、保肝、提高機體免疫力及抗腫瘤等多種生物活性[3-4]。葫蘆素B(Cucurbitacin B，CuB)是其中含量最為豐富的一類，目前對其研究也很多。葫蘆素B具有多種生物活性，目前主要用于慢性肝炎和肝癌的治療[5-8]。近年的研究報道顯示，低濃度的葫蘆素B可以對多種腫瘤細(xì)胞起到抑制作用，如白血病、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等[9-14]，而且葫蘆素B在不同腫瘤細(xì)胞中的作用機制并不完全相同。有關(guān)葫蘆素B對胃癌的作用及其內(nèi)在機制的研究，國內(nèi)外尚未見報道。本試驗通過檢測葫蘆素B對人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖及凋亡的影響，從分子水平上研究葫蘆素B對胃癌細(xì)胞的影響及內(nèi)在機制，為胃癌的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料與試劑人胃癌BGC-823細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所；葫蘆素B購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清購自天津灝洋生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒及Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；β-actin、Bcl-2和Bax抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自武漢博士德生物工程公司；增強化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific Pierce公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌BGC-823細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，鏡下觀察細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3MTT 法檢測細(xì)胞增殖將消化收集好的BGC-823細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整成濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁后，分別加入含不同濃度葫蘆素B的培養(yǎng)液，使其終濃度分別為0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組以及陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩至結(jié)晶溶解后，酶標(biāo)儀(波長570 nm)檢測每孔光密度值(OD值)。增殖抑制率按如下公式計算：抑制率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將人胃癌BGC-823細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×105個，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含0.1、0.5 μmol/L葫蘆素B的培養(yǎng)液，并設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)離心洗滌細(xì)胞2次。加入500 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，各加入10 μL Annexin V-FITC及5 μL PI，進(jìn)行雙染色，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，上機檢測。Cellquest專業(yè)軟件獲取分析數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次。

1.5檢測Caspase-3、Caspase-9活性將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞生長24 h后加入0.1 μmol/L的葫蘆素B溶液，并設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24 h后以0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 γ/min離心5 min)，收集3×105個細(xì)胞，加入50 μL冰冷Caspase Lysis Buffer，使用前每50 μL裂解液加入0.5 μL二硫蘇糖醇(Dithiothreito，DTT)，冰浴裂解，提取蛋白。Bradford法測定蛋白濃度。吸取50 μL含200 μg蛋白的細(xì)胞裂解上清(各組均采用相同的蛋白量進(jìn)行測定和比較，如體積不足50 μL，用PBS補充總體積至50 μL)，加入50 μL 2×Reaction Buffer，使用前每50 μL 2×Reaction Buffer加入0.5 μL DTT。加入5 μL Caspase-3或Caspase-9 substrate，37 ℃避光孵育4 h，酶標(biāo)儀值(λ=405 nm)測定OD值，通過計算實驗組OD值/對照組OD值來檢測Caspase-3/-9的活化程度。以50 μL Lysis Buffer+50 μL 2×Reaetion Buffer作為空白對照。實驗重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)將BGC-823細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，生長24 h后加入含0.1、0.5 μmol/L葫蘆素B的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加等量RPMI-1640培養(yǎng)基作為陰性對照。冰浴裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，測定并調(diào)整蛋白濃度。灌制分離膠為12%、濃縮膠為5%的SDS-PAGE凝膠。樣品與2倍濃度的上樣緩沖液以體積比1∶1混合，40 μg/孔上樣，90 V電泳至濃縮膠分離膠界面，再120 V電泳至凝膠底部。濕法電轉(zhuǎn)恒壓100 V，120 min，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉(含0.1% Tween 20)室溫封閉1 h，洗膜后加入1∶500稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶結(jié)合的相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h。增強化學(xué)發(fā)光顯影，UVI凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1葫蘆素B抑制BGC-823細(xì)胞的增殖MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞均有增殖抑制作用。增殖抑制作用隨著藥物濃度的增大及作用時間的延長而增強，表明葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。經(jīng)ANOVA方差分析，P<0.05。經(jīng)LSD-t檢驗，不同劑量組之間、不同時間組之間及其與對照組之間均有顯著性差異(P<0.05)，見圖1。

圖1　葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞的增殖抑制作用(MTT法)

2.2葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞凋亡的影響用0.1、0.5 μmol/L的葫蘆素B作用于BGC-823細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測胃癌細(xì)胞凋亡情況。見圖2。結(jié)果表明，BGC-823細(xì)胞凋亡率隨著葫蘆素B給藥濃度的增加而增加。與對照組相比，0.1、0.5 μmol/L的葫蘆素B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

圖3　0.1、0.5 μmol/L葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞凋亡的影響

2.3葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響0.1 μmol/L葫蘆素B處理BGC-823細(xì)胞24 h后，Caspase-3和Caspase-9被活化，從而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，見圖4。

2.4葫蘆素B對人胃癌BGC-823細(xì)胞Bcl-2、Bak蛋白表達(dá)水平的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，0.1、0.5 μmol/L的葫蘆素B作用于BGC-823細(xì)胞24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)逐漸下降，促凋亡蛋白Bak表達(dá)升高，隨葫蘆素B作用濃度的增加，這種趨勢更加明顯，見圖5。

3討論

目前，臨床常用的胃癌化療藥物有氟尿嘧啶、鉑類及紫衫醇類，藥物的毒副反應(yīng)均相當(dāng)嚴(yán)重，而患者的平均生存期未明顯提高，因此，尋找高效、低毒的胃癌治療藥物尤為重要。近年來，隨著中藥抗腫瘤作用的實驗和臨床研究的深入開展，中藥復(fù)方及天然單體成分在腫瘤治療中的地位日趨受到重視，越來越多的中藥復(fù)方及單體成分逐漸應(yīng)用于臨床化療及輔助化療[15-16]。已有多項研究表明，葫蘆素B可以體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[9-14]，同時對化療亦有增敏作用。

圖4　葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性的影響

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞的程序性死亡，在生物的發(fā)育和進(jìn)化中起著至關(guān)重要的作用。一般認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞異常增殖和分化的結(jié)果，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)，是細(xì)胞的凋亡機制受到抑制，機體不能及時清除體內(nèi)過多的、受損傷的或惡變的細(xì)胞的結(jié)果。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤藥物治療的主要目標(biāo)。

圖5　葫蘆素B對BGC-823細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡的機制非常復(fù)雜，一般分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑始于線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放[17]，Caspase級聯(lián)反應(yīng)和Bcl-2家族蛋白的調(diào)控等都是影響細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡的重要機制[18]。Caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族，廣泛表達(dá)于正常人體組織及多種腫瘤組織中，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類蛋白水解酶，它們引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的中心環(huán)節(jié)，并可通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡。大量資料顯示，在許多腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中有Caspase的活化。細(xì)胞接收到凋亡信號后，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿中，激活下游的Caspase-9，進(jìn)而使Caspase蛋白酶發(fā)生酶解級聯(lián)激活，包括Caspase-2、3、6、7、8、10等。其中Caspase-3是最重要的凋亡效應(yīng)因子，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用，與染色體聚集、DNA斷裂及凋亡小體的形成有關(guān)，可能是凋亡事件的真正執(zhí)行者[19-20]。Bcl-2家族蛋白通過維持線粒體膜的穩(wěn)定性來影響細(xì)胞內(nèi)源性凋亡，其中Bcl-2蛋白起到維持線粒體膜穩(wěn)定性的作用，控制著細(xì)胞色素C等物質(zhì)的釋放，以起到抗凋亡的作用，Bax蛋白可通過破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，以達(dá)到促凋亡的作用，Bcl-2/Bax蛋白通過同源和異源二聚體來共同調(diào)節(jié)線粒體膜的穩(wěn)定性，是細(xì)胞凋亡的最有效指標(biāo)之一[21]。

本研究結(jié)果顯示，葫蘆素B可以顯著抑制胃腺癌細(xì)胞BGC-823的增殖，增殖抑制效應(yīng)呈劑量和時間依賴性。Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，0.1、0.5 μmol/L的葫蘆素B可使BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡，且作用呈劑量依賴性。Caspase-3、Caspase-9活性檢測表明，葫蘆素B處理使BGC-823細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3和Caspase-9被活化。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，葫蘆素B處理組細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)明顯，與此同時促凋亡蛋白Bax上調(diào)。上述結(jié)果提示，葫蘆素B促BGC-823細(xì)胞凋亡的機制可能是因為下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、上調(diào)促凋亡蛋白Bax，并最終破壞了線粒體膜完整性，進(jìn)而激活Caspase-3來促發(fā)的，為進(jìn)一步研究葫蘆素B在抗腫瘤治療中的作用提供了依據(jù)。

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Effects of cucurbitacin B on proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma BGC-823 cells

ZHANG Menga,BIAN Zhi-gangb,HE Pinga*

(a.Department of Geriatrics Medicine,b.Department of Rhinology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of cucurbitacin B on the proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma BGC-823 cells,and to clarify the molecular mechanism.MethodsThe BGC-823 cells were cultured in vitro.MTT assay was used to test the growth inhibitory effect of cucurbitacin B on BGC-823 cells.Apoptosis rate was determined by flow cytometry analysis.Spectrophotometric method was used to determine the activity of Caspase-3 and Caspase-9.The expression of Bcl-2 and Bax was determined by Western blot after cucurbitacin B treatment.ResultsThe growth of BGC-823 cells was inhibited by cucurbitacin B in a dose-and time-dependent manner.Flow cytometry analysis showed that cucurbitacin B could induce BGC-823 cells apoptosis in a dose-dependent manner.The activity of Caspase-3 and Caspase-9 was increased after treatment with cucurbitacin B.The anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated,and the pro-apoptotic protein Bak was up-regulated.ConclusionCucurbitacin B can inhibit the growth of BGC-823 cells and induce cell apoptosis.

Key words：Cucurbitacin B；Gastric carcinoma；Apoptosis

收稿日期：2015-12-20

基金項目：盛京醫(yī)院院內(nèi)課題(MD55)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605006