汪　洋，陳　璐，李晉奇，邊　原，胡　遠(yuǎn)

HPLC法測定補氣生血口服液中三種組分的含量

汪洋1，陳璐2*，李晉奇2，邊原2，胡遠(yuǎn)2

1.成都市食品藥品檢驗研究院，成都610045；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，成都610072

[摘要]目的建立以高效液相色譜測定補氣生血口服液中黃芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸含量的方法。方法三組分均采用phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；黃芪甲苷測定的流動相為水-乙腈(60∶40)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；ELSD檢測器；漂移管溫度：105 ℃；氣流速度：2.5 L/min。二苯乙烯苷與阿魏酸測定流動相為乙腈-水(20∶80)；流速1.0 mL/min；檢測波長：248 nm；柱溫30 ℃。結(jié)果補氣生血口服液中黃芪甲苷在0.22～5.72 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為91.2%。在相同色譜條件下，二苯乙烯苷與阿魏酸分離度好，二苯乙烯苷在9.83～393.00 μg/mL范圍內(nèi)、阿魏酸在1.015～50.756 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率分別為90.7%和92.8%。結(jié)論該方法簡便、快捷、專屬性強，為其質(zhì)量控制與含量測定提供了重要參考。

[關(guān)鍵詞]補氣生血口服液；HPLC法；黃芪甲苷；二苯乙烯苷；阿魏酸

0引言

補氣生血口服液為四川省人民醫(yī)院醫(yī)院制劑，常用于斑禿及脂溢性脫發(fā)等，具有增強免疫的功能，至今已有十余年歷史[1]。但該制劑以往的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有外觀性狀、相對密度、酸堿度以及鑒別項檢查，而缺少含量檢測項，不利于該制劑的質(zhì)量控制。因此，本文采用HPLC法測定補氣生血口服液中黃芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸的含量，并以此為根據(jù)，建立控制該口服液質(zhì)量的方法，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，島津LC-10ATvp液相色譜儀。黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613)、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D葡萄糖苷(批號：110844-201109，含量測定用，含量94.7%，中國食品藥品檢定研究院)、阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201012，含量：99.6%)，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。補氣生血口服液(自制，批號：20140831、20140706、20140610)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

2.1.1黃芪甲苷色譜柱：phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水-乙腈(60∶40)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；ELSD檢測器(型號：Alltech 2000)；漂移管溫度：105 ℃；氣流速度：2.5 L/min。黃芪甲苷出現(xiàn)較好色譜峰，峰型良好。

2.1.2二苯乙烯苷和阿魏酸色譜柱：phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-水(20∶80)，流速:1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：248 nm，進樣量：10 μL。在此條件下，供試品中二苯乙烯苷和阿魏酸均出現(xiàn)較好的色譜峰，兩組分分離完全。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的黃芪甲苷對照品14.30 mg，加甲醇稀釋至250.0 mL，制成57.2 μg/mL的對照品儲備液。精密稱取二苯乙烯苷對照品9.825 mg，加甲醇溶解后置25 mL量瓶中，并定容至刻度，得濃度為393.0 μg/mL的對照品儲備液。取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥18 h的阿魏酸對照品12.74 mg，加甲醇稀釋至50.0 mL，制成253.781 μg/mL的對照品儲備液。

2.2.2供試品溶液的制備①黃芪甲苷[2]：取補氣生血口服液2.0 mL，加入2 mL水飽和后的正丁醇，渦旋1 min，靜置，分取上層正丁醇液1.5 mL于另一試管中。將剩下的溶液重復(fù)提取3次，合并正丁醇液，加入2 mL氨試液，渦旋1 min，2 500 r/min離心2 min，分離棄去氨水層，重復(fù)提取2次后，正丁醇層85 ℃水浴氮氣吹干，加入200 μL甲醇復(fù)溶后，10 μL進樣。②阿魏酸和二苯乙烯苷：取補氣生血口服液0.5 mL，精密加入1.5 mL甲醇，搖勻，稀釋液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液10 μL進樣。

2.2.3空白供試品溶液的制備取處方比例輔料，按復(fù)方黃芪口服液制備工藝分別制得黃芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸3種空白口服液，再按“2.2.2”項下制備方法制得其3種成分對應(yīng)的空白供試品溶液。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1線性關(guān)系考察①黃芪甲苷：取黃芪甲苷甲醇儲備液，加甲醇稀釋，制成濃度分別為5.72、3.43、1.72、0.86、0.43、0.22 μg/mL的對照品溶液。分別取10 μL進樣，測定黃芪甲苷峰面積。②二苯乙烯苷：精密取“2.2.1”項下的二苯乙烯苷對照品儲備液7.0、5.0、2.5、1.3、0.6、0.25 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。得濃度分別為393.00、275.10、196.50、98.75、51.09、23.58、9.83 μg/mL的對照品溶液。分別取10 μL進樣，測定二苯乙烯苷峰面積。③阿魏酸：精密取“2.2.1”項下阿魏酸對照品儲備液5.0、3.0、1.5、0.5、0.2、0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。得濃度分別為50.756、30.454、15.227、5.076、2.030、1.015 μg/mL的對照品溶液。分別取10 μL進樣，測定阿魏酸峰面積。

以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)分別對以上3種組分進行線性回歸，回歸方程、相關(guān)系數(shù)與測定范圍見表1。

表1　三種組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及測定范圍

2.3.2專屬性實驗色譜圖見圖1、圖2。

圖1　黃芪甲苷HPLC法色譜圖

圖2　二苯乙烯苷與阿魏酸HPLC法色譜圖

2.3.3穩(wěn)定性實驗取3個組分對照品溶液與補氣生血口服液樣品，分別在0、1、2、6、12、24 h測定3個組分峰面積。按“2.1”項色譜條件進樣分析，求得在24 h內(nèi)黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸對照品溶液峰面積的RSD值分別為1.47%、2.13%、1.98%，結(jié)果表明，在24 h內(nèi)樣品溶液中3個組分的含量是穩(wěn)定的。

2.3.4精密度實驗分別將黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸對照品溶液重復(fù)測定6次，計算黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的RSD分別為2.26%、1.79%、2.51%，說明精密度良好。

2.3.5重復(fù)性實驗[3]取補氣生血口服液6瓶(批號：20140831)，傾出內(nèi)容物，按“2.2.2”項下分別精密量取適量口服液，分別制備3個組分供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別測定黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面積，乘以其稀釋倍數(shù)，再計算濃度。黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的RSD(n=6)分別為1.45%、0.78%、0.91%。

2.3.6加樣回收率實驗[4]取補氣生血口服液6瓶(批號：20140831)，傾出內(nèi)容物，按“2.2.2”項下分別精密量取適量口服液，精密加入對應(yīng)的對照品，分別制備3個組分供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別測定黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面積，乘以其稀釋倍數(shù)，再計算濃度。測得加樣回收率分別為91.2%、90.7%、92.8%，RSD分別為2.34%、2.75%、2.08%。

2.4樣品測定取補氣生血口服液3批各6瓶，傾出內(nèi)容物，按“2.2.2”項下制備3個組分供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別測定其黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸的峰面積，乘以其稀釋倍數(shù)，即得濃度。補氣生血口服液樣品中黃芪甲苷、二苯乙烯苷、阿魏酸濃度見表2。

表2　補氣生血口服液3個組分含量測定(μg/mL)

3討論

3.1補氣生血口服液由四川省人民醫(yī)院使用多年的經(jīng)驗方提煉而成，由黃芪、當(dāng)歸、制何首烏、枸杞子、黨參5味藥材組成，具有養(yǎng)血活血、增強免疫與造血功能的功效。其中黃芪為君藥，當(dāng)歸與制何首烏為臣藥，本文用HPLC法對該口服液中君藥、臣藥的主要成分進行含量檢測，為補氣生血口服液的質(zhì)量控制提供了重要參考[5]。

3.2二苯乙烯苷存在順式與反式2種異構(gòu)體，一般以反式體存在。反式體的最大吸收波長為322、236 nm，而阿魏酸最大吸收波長為323 nm[6]。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，在同一色譜條件下，波長248 nm處，二苯乙烯苷與阿魏酸的峰型對稱性與分離度良好，且在出峰位置無雜質(zhì)干擾，故選用248 nm為測定波長。

3.3在同時測定二苯乙烯苷、阿魏酸含量時，筆者根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]比較了多種流動相系統(tǒng)，包括乙腈-水(25∶75)、乙腈-0.1%乙酸水(25∶75)、乙腈-水(20∶80)，結(jié)果表明，采用乙腈-水(20∶80)后基線平穩(wěn)，二苯乙烯苷峰型好，各峰均沒有拖尾，故選擇流動相為乙腈-水(20∶80)。

3.4黃芪甲苷的測定方法較多，包括分光光度法、薄層掃描法、高效液相-紫外檢測法、HPLC-ELSD法等[8]。HPLC-紫外檢測法對于僅有末端吸收的皂苷類化合物，雜質(zhì)干擾較大，吸收較弱，準(zhǔn)確度較差。HPLC-ELSD法適于僅有末端吸收或無紫外吸收的皂苷類化合物的測定，其不依賴于樣品的光學(xué)特性，不受官能團影響，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，適合用于測定黃芪甲苷的含量。因此可采用HPLC-ELSD法測定補氣生血口服液中黃芪甲苷的含量[9]。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳勇,王亞非.黃芪注射液輔助雷替曲塞聯(lián)合奧沙利鉑治療晚期結(jié)直腸癌[J].中國新藥與臨床雜志,2014,33(3):218-221.

[2]楊素芹,劉文惠,張繼敏,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大鼠血漿中黃芪甲苷及其藥動學(xué)[J].中國新藥與臨床雜志,2011,30(9):705-709.

[3]王娟,汪選斌,李洪亮,等.HPLC法測定補腎化瘀浸膏中毛蕊花糖苷的含量[J].實用藥物與床,2015,18(9):1082-1083.

[4]樊建霜,王家員,林方芬,等.HPLC法測定四逆清帶口服液中芍藥苷的含量[J].實用藥物與臨床,2015,18(3):310-312.

[5]李瓊,曾銳,楊學(xué)森.參芪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(1):100-102.

[6]孫晉苓,黃曉蘭,吳惠勤,等.何首烏中順式和反式-二苯乙烯苷的HPLC/DAD/MS測定及其光穩(wěn)定性考察[J].中國中藥雜志,2009,44(7):541-544.

[7]張鳳瑞,周賢,劉炎,等.當(dāng)歸補血湯中當(dāng)歸的鑒別及阿魏酸的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2014,25(1):98-100.

[8]鐘華,李毅,周淑芳,等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射測定杞黃顆粒中黃芪甲苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(2):401.

[9]李毅,王穎,張廷模.活血散結(jié)合劑中黃芪甲苷含量的測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(3):768-769.

Content determination of three in gradients in buqi shengxue oral liquid by HPLC

WANG Yang1,CHEN Lu2*,LI Jin-qi2,BIAN Yuan2,HU Yuan2

(1.Chengdu Institutes of Food and Drug Control,Chengdu 610045,China; 2.Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu 610072,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,ferulic acid and astragaloside Ⅳ in buqi shengxue oral liquid.MethodsThe content of three ingredients was determined by phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column.The content of astragaloside was determined by HPLC with the mobile phase of acetonitrile-water (40∶60),the column temperature was 30 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min,and the sample size was 10 μL; ELSD detector was used; the drift tube temperature was 105 ℃,and the air speed was 2.5 L/min.HPLC was adopted to determine the content of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside and ferulic acid with methanol-water (20∶80) as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min with the detection wavelength of 248 nm,and the column temperature was 30 ℃.ResultsThe calibration curve had good linear relationship in the range of 9.83～393.00 μg/mL for 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucoside,1.015～50.756 μg/mL for ferulic acid,0.22～5.72 μg/mL for astragaloside Ⅳ.The average recovery was 90.7%,92.8% and 91.2%.ConclusionThe method is accurate and reliable,which can be used for the quality control and content determination of buqi shengxue oral liquid.

Key words：Buqi shengxue oral liquid; HPLC; AstragalosideIV; 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside; Ferulic acid

收稿日期：2015-09-21

基金項目：四川省中醫(yī)藥管理局青年中醫(yī)藥課題(2010-64)；四川省人民醫(yī)院2014年苗圃計劃

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605025