劉艷紅,李光偉,劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥　230009)

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提高番茄品質(zhì)的番茄去泛素化酶基因AMSH3

劉艷紅,李光偉,劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009)

摘要:AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM 蛋白酶家族的一員,能結(jié)合泛素化蛋白上的泛素分子。文章在番茄中發(fā)現(xiàn)了一去泛素化酶基因SlAMSH3,與擬南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分別有81%和71%的相似性。擬南芥中去泛素化酶AtAMSH3會(huì)影響植物液泡的形成和液泡蛋白的運(yùn)輸途徑。文章構(gòu)建了SlAMSH3果實(shí)特異表達(dá)的過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到野生型番茄中,通過(guò)篩選獲得SlAMSH3在果實(shí)中高表達(dá)陽(yáng)性株系,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)分析顯示,轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中SlAMSH3的表達(dá)量明顯高于野生型果實(shí)(p<0.05)。文章測(cè)定了陽(yáng)性番茄株系綠熟期果實(shí)葉綠素質(zhì)量濃度及紅熟期果實(shí)的單果質(zhì)量、果實(shí)糖度、果實(shí)硬度、番茄紅素質(zhì)量濃度和β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的葉綠素總質(zhì)量濃度、番茄紅素和β-胡蘿卜素比野生型分別提高178.61%、40.53%和74.86%,其他指標(biāo)無(wú)顯著差異。因此，SlAMSH3果實(shí)特異過(guò)表達(dá)的方法能夠改良番茄果實(shí)品質(zhì),為基因工程方法改良番茄果實(shí)品質(zhì)做出了新嘗試。

關(guān)鍵詞:AMSH3基因;果實(shí)特異過(guò)表達(dá);遺傳轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)基因番茄;果實(shí)品質(zhì)改良

0引言

植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段,包括胚胎發(fā)生、種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、果實(shí)成熟和葉片衰老等都受到多種激素信號(hào)的控制[1]。雖然植物激素的分子結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,但具有十分復(fù)雜的生理效應(yīng)[2]。大量研究表明,泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在植物生長(zhǎng)發(fā)育,包括激素合成、感知和下游信號(hào)傳導(dǎo)、自交不親和、抗病、表觀遺傳及植物形態(tài)建成等過(guò)程都發(fā)揮著重要作用[3]。該途徑也是一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的可逆過(guò)程,其中去泛素化酶的調(diào)節(jié)是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。

目前研究證實(shí),細(xì)胞內(nèi)廣泛存在許多去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs),主要分為以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特異性加工酶家族為主的5種類型,分別為泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C2 terminal hydrolases,UCHs)、泛素特異性加工酶家族(ubiquitin-specific processing enzymes,UBPs或ubiquitin- specific proteases,USPs)、卵巢腫瘤(OTU)相關(guān)蛋白酶、Ataxin-3、MPN(+)/JAMM 蛋白酶[4]。這些不同類型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上的泛素鏈之間的鏈接,起到去泛素化的作用,對(duì)蛋白降解進(jìn)行反向調(diào)節(jié),從而影響蛋白質(zhì)的功能。去泛素化酶是一類數(shù)量很大的蛋白酶家族，去泛素化酶識(shí)別泛素、底物或者蛋白酶體的特異性序列[5],主要是作用于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中已泛素化的蛋白底物,通過(guò)水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵,將泛素分子特異性從連接有泛素的蛋白或者前體蛋白上脫離出來(lái),重新進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)蛋白調(diào)節(jié)的循環(huán)中[6]。

AMSH3酶是去泛素化酶中MPN(+)/JAMM 蛋白酶家族的一員，是一類能結(jié)合泛素化蛋白上泛素分子的金屬蛋白酶,具有MPN序列,或稱JAMM(Jab1/MPN domain associated metalloisopeptidase)序列。這一序列含有較為保守的2個(gè)組氨酸殘基和1個(gè)天冬氨酸殘基,它們與二價(jià)鋅離子共同構(gòu)成催化中心[7]。泛素和去泛素不僅對(duì)各種細(xì)胞的生理過(guò)程有重要的影響,也對(duì)細(xì)胞器的形成發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中,AtAMSH3酶不僅能夠水解植物體外和積累在體內(nèi)的K48-和K63-鏈接的2種泛素鏈,而且是苯乙烯基染料FM64和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)因子PIN2進(jìn)行高效細(xì)胞內(nèi)吞作用所必須的。而AMSH3突變體植株不僅不能形成中央裂解大液泡和積累吞噬體,還會(huì)將液泡蛋白錯(cuò)誤地運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞間隙中[8]。

成熟的番茄果實(shí)是人類攝取天然類胡蘿卜素和番茄紅素的主要來(lái)源,研究人員為了提高番茄果實(shí)品質(zhì),通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行了廣泛嘗試,研究發(fā)現(xiàn)使用果實(shí)特異性表達(dá)啟動(dòng)子TMF7比使用CaMV35S等組成型啟動(dòng)子效果好很多[9-10]。

一方面,使用CaMV35S等組成型啟動(dòng)子增加或降低某一關(guān)鍵基因的表達(dá)會(huì)引起許多負(fù)面效應(yīng)；另一方面,TMF7啟動(dòng)子由于可以控制外源基因在果實(shí)中高效表達(dá),避免了外源基因在植物的其他組織器官中的積累,減少了對(duì)植物的不利影響[9-10]。因此通過(guò)組織、器官特異性啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確調(diào)控,成為提高外源基因表達(dá)效率的有益實(shí)驗(yàn)而得到廣泛應(yīng)用[11]。

本文通過(guò)生物信息比對(duì)，在番茄中發(fā)現(xiàn)了與擬南芥AtAMSH3同源性較高的SlAMSH3,克隆了番茄SlAMSH3基因,利用植物過(guò)表達(dá)載體pBI121-TMF7,在番茄植株中過(guò)表達(dá)SlAMSH3基因,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)野生型番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并利用轉(zhuǎn)基因植株研究了SlAMSH3果實(shí)特異過(guò)表達(dá)對(duì)番茄品質(zhì)的影響。

1材料與方法

番茄(Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig)、大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株、農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105及PBI121-35S-GFP 載體和番茄表達(dá)載體pBI121-TMF7 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol購(gòu)自于Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶、pEASY-Blunt載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN 公司。

1.1番茄AMSH3基因的克隆

按照Sol Genomics Network中番茄SlAMSH3基因序列(登錄號(hào)Solyc01g060280.2.1)設(shè)計(jì)引物AMSH3-F1、AMSH3-R1,用于構(gòu)建pBI121-TMF7-SlAMSH3載體。提取野生型番茄幼苗總RNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增SlAMSH3基因。PCR條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s;57℃ 30 s;72℃ 108 s,32 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將PCR 產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對(duì)重組子進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證,陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2AMSH3果實(shí)特異過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

參照載體pEASY-Blunt和pBI121-TM-F7的酶切位點(diǎn),采用Sequencher軟件對(duì)SlAMSH3基因序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析,運(yùn)用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異引物,見表1所列。分別以測(cè)序正確后的SlAMSH3重組質(zhì)粒和pBI121-TMF7載體做雙酶切并膠回收目的片段和載體片段,將目的片段連接到pBI121-TMF7載體上,則構(gòu)建成番茄果實(shí)特異的pBI121-TMF7-SlAMSH3植物過(guò)表達(dá)載體。將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽(yáng)性菌落,提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。

表1　本研究所用的引物

1.3番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)[12-13],將重組質(zhì)粒pBI121-TMF7-SlAMSH3通過(guò)液氮冷擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,在含有利福平和卡那霉素(50 mg/L)的培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2 d,陽(yáng)性菌用以轉(zhuǎn)化野生型番茄。番茄種子用自來(lái)水浸泡12 h,先用75%的酒精漂洗2 min,再用15%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min,用無(wú)菌水漂洗6次后播種至1/2 MS培養(yǎng)基。22℃,4 d左右,露白后轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)。待子葉完全舒展開時(shí),將子葉剪下置于預(yù)培養(yǎng)基(MS+1 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA)上培養(yǎng)2 d;將帶有pBI121-TMF7-SlAMSH3載體的農(nóng)桿菌28℃過(guò)夜培養(yǎng),室溫下5 000 r/min離心5 min收集菌。

用稀釋后的農(nóng)桿菌浸染預(yù)培養(yǎng)3 d的子葉10 min;吸去子葉上多余菌液后,將子葉轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)基(MS+1 mg/L KT+1 mg/L 2,4-D+10 mg/L ACE)上培養(yǎng)2 d;然后轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基(MS+500 mg/L SB+2 mg/L 6-BA+50 mg/L KANA+0.2 mg/L IAA)上,22℃下光照培養(yǎng)(16 h 光照,8 h黑暗),每21 d更換1次培養(yǎng)基;待愈傷組織上長(zhǎng)出的不定芽長(zhǎng)至2 cm左右時(shí),將芽切下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS+500 mg/L SB+2 mg/L IAA+50 mg/L KANA)上生根;移入營(yíng)養(yǎng)土,放于溫室中栽培，提取番茄基因組DNA。以DNA為模版,pBI121-TMF7質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,同時(shí)用野生型番茄DNA作為陰性對(duì)照,根據(jù)pBI121 載體篩選標(biāo)記基因新霉素磷酶基因(NPTⅡ)(登錄號(hào) AF485783)序列合成引物NPTⅡ-F 和NPTⅡ-R,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 鑒定。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸50 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因T1代果實(shí)總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。SlAMSH3基因使用的引物是AMSH3DL-F、AMSH3DL-R。以番茄UBI為內(nèi)參基因(登陸號(hào)X58253),其PCR擴(kuò)增引物為UBIDL-F、UBIDL-R。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火20 s,40個(gè)循環(huán);95℃15 s,60℃延伸1 min,95℃15 s。

1.5葉綠素質(zhì)量濃度的測(cè)定

葉綠素質(zhì)量濃度測(cè)定按照文獻(xiàn)[14-16]介紹的方法,剪取番茄綠熟期果實(shí)果皮0.2～0.5 g,液氮充分研磨,用1 mL 80%的丙酮充分萃取,萃取液離心后用分光光度計(jì)檢測(cè),讀取645 nm和663 nm下的光吸收值A(chǔ)645和A663。按照MacKinney常數(shù)計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度，其具體計(jì)算公式為:

ρ(葉綠素a)=12.7(A663)-2.69(A645),

ρ(葉綠素b)=22.9(A645)-4.48(A663)。

1.6番茄紅素和β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的測(cè)定

番茄紅素和β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)[17],取同一紅熟期的番茄果實(shí)相同部位的果皮0.5～1.0 g,液氮充分研磨,加2 mL丙酮室溫下萃取10 min。再加入2 mL的二氯甲烷震蕩?kù)o置10 min,短瞬離心后,吸取帶有顏色的上清低溫保存(整個(gè)過(guò)程要避光)。萃取的樣品使用C18色譜柱Spherisorb ODS-2 column(silica 5 mm,3.2 mm×250 mm)(Phenomenex?)進(jìn)行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。每個(gè)萃取的樣品吸取20 μL上柱,流動(dòng)相的組成為乙晴、二氯甲烷、甲醇，三者的體積比為7∶2∶7,流速1 mL/min。使用二極管檢測(cè)器(Waters 2996 photo diode-array detector)在260～600 nm范圍內(nèi)檢測(cè)光的吸收峰,記錄所有的峰圖和特征光譜。同時(shí),用番茄紅素和β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行HPLC分析,作為陽(yáng)性對(duì)照,將其特征光譜、保留時(shí)間與待測(cè)樣品進(jìn)行比較,采用HITACHI軟件(EZChrom Elite for Hitachi Version 3.1.5a)分析算出樣品中番茄紅素和β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。

2結(jié)果與分析

2.1SlAMSH3基因擴(kuò)增與測(cè)序

以番茄cDNA為模板,分別以AMSH3-F1和AMSH3-R1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物為一條特異條帶,如圖1所示。

由圖1可知，與預(yù)期的番茄SlAMSH3基因片段大小1 740 bp一致。測(cè)序結(jié)果序列與番茄SlAMSH3基因的預(yù)測(cè)序列一致。

M—DNA marker DL2000 plus　1.目的基因

2.2表達(dá)載體鑒定

用XbaⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切得到與預(yù)期結(jié)果相同的SlAMSH3片段,如圖2所示，證明SlAMSH3已經(jīng)連接到植物表達(dá)載體pBI121上。

M—DNA marker DL2000 plus

2.3轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株,從葉片中提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,利用植物表達(dá)載體pBI121 攜帶的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因?qū)χ仓赀M(jìn)行陽(yáng)性鑒定,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 857 bp。共得到組培苗8株,其中6株經(jīng)過(guò)鑒定為轉(zhuǎn)基因番茄苗。

8株的PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，圖3表明,對(duì)照野生型植株未能擴(kuò)增出857 bp 的條帶,而抗性植株和陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出857 bp 的條帶,說(shuō)明攜帶NPTⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。

M—DNA marker DL2000 plus

2.4轉(zhuǎn)基因植株的表型

pBI121-TMF7-SlAMSH3轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比,具有明顯差異。轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)顏色在各生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期均比野生型植株的果實(shí)要更深一些,更綠一些。成熟轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)也比野生型植株的果實(shí)更紅一些。

2.5SlAMSH3的表達(dá)水平

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分析結(jié)果,分析轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)中過(guò)表達(dá)基因SlAMSH3的表達(dá)水平,結(jié)果如圖4所示,轉(zhuǎn)基因植株SLAMSH3基因的表達(dá)水平很高。說(shuō)明轉(zhuǎn)入pBI121-TMF7-SlAMSH3植物過(guò)表達(dá)載體后,番茄SlAMSH3基因得到了顯著過(guò)表達(dá)(p<0.05)。

圖4　轉(zhuǎn)基因番茄SlAMSH3表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

2.6果實(shí)葉綠素質(zhì)量濃度的測(cè)定

每一植株取綠熟期番茄果實(shí)各6個(gè),每組重復(fù)測(cè)定3次，果實(shí)葉綠素的質(zhì)量濃度如圖5所示。由圖5可看出,轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的總?cè)~綠素和葉綠素a的質(zhì)量濃度比野生型分別提高約178.61% 和185.51%。

圖5　野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)葉綠素質(zhì)量濃度

2.7番茄紅素及β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的測(cè)定

野生型與轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)番茄紅素和β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度如圖6所示。

由圖6可以看出,在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)熟果中的番茄紅素和β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度均比野生型中兩者的質(zhì)量濃度高，分別提高約40.53%和74.86%。

圖6　番茄紅素和β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度分析

2.8果實(shí)糖度、直徑、質(zhì)量及硬度的測(cè)定

取每一植株紅熟期番茄果實(shí)各15個(gè),每組3次重復(fù)測(cè)定果實(shí)糖度、直徑、單果質(zhì)量及硬度,結(jié)果如圖7所示。

由圖7可看出,轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的糖度、質(zhì)量、直徑及硬度比野生型番茄的均有所提高，但無(wú)顯著性的差異。

圖7　紅熟期番茄果實(shí)糖度、直徑、質(zhì)量及硬度的分析

3結(jié)果與討論

研究表明,在植物體內(nèi),SlAMSH3基因影響細(xì)胞器的發(fā)育[8],本文將番茄的SlAMSH3基因通過(guò)pBI121-TMF7載體在番茄中過(guò)表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株中SlAMSH3基因在番茄植株得到了過(guò)表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出綠果顏色變深性狀。

本實(shí)驗(yàn)研究表明,過(guò)表達(dá)SlAMSH3的轉(zhuǎn)基因植株綠熟期果實(shí)的總?cè)~綠素質(zhì)量濃度比同期野生型果實(shí)提高約178.61%。過(guò)表達(dá)SlAMSH3的轉(zhuǎn)基因植株紅熟期果實(shí)的番茄紅素和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度比野生型的分別提高約40.53%和74.86%。過(guò)表達(dá)SlAMSH3的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的糖度、質(zhì)量及硬度均比野生型番茄的有所提高，但無(wú)顯著性的差異。

本文將SlAMSH3在番茄植株中過(guò)表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)SlAMSH3過(guò)表達(dá)可以提高番茄果實(shí)中的葉綠素、番茄紅素、類胡蘿卜素等的質(zhì)量濃度,并沒有對(duì)SlAMSH3的相關(guān)功能及其作用機(jī)理作出分析,后續(xù)試驗(yàn)將深入研究SlAMSH3在番茄中的功能作用及其可能的作用機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]覃碧.泛素蛋白酶體途徑及其對(duì)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào) 控[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,33(4):39-44.

[2]宋素勝,謝道昕.泛素蛋白酶體途徑及其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控[J].植物學(xué)通報(bào),2006,65(5):324-328.

[3]Santner A,Calderon-Villalobos L I,Estelle M.Plant hormones are versatile chemical regulators of plant growth[J].Nature Chemical Biology,2009,268(5):89-92.

[4]王素霞,劉媛,吳慧娟,等.去泛素化酶的研究及其進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2008,24(6):201-204.

[5]Li Y,Song P.The biochemical and biological functions of ubiquitination/deubiquitination system[J].Chemistry of Life,2006,26(6):1000-1336.

[6]Schreiner P,Chen K,Husnjak K,et al.Ubiquitin docking at the proteasome through a novel pleckstrin-homology domain interaction[J].Nature,2008,453(7194):548-552.

[8]Erika I,Anthi K,Isabel K M,et al.The deubiquitinating enzyme AMSH3 is required for intracellular trafficking and vacuole biogenesis in arabidopsis thaliana[J].Plant Cell,2010,22:1826-1837.

[9]周昂,牛向麗,劉永勝.獼猴桃AcGLK2a基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,38(2):246-249.

[10]Liu Y,Roof S,Ye Z,et al.Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:9897-9902.

[11]Davuluri G R,Tuinen A,Fraser P D,et al.Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes[J].Nat Biotechnol,2005,23:890-895.

[12]Gao Y F,Liu J K,Zhang Z G,et al.Functional characterization of two alternatively spliced transcripts of tomato ABSCISIC ACID INSENSITIVE3(ABI3)gene[J].Plant Mol Biol,2013,82:131-145.

[13]Tang X F,Tang Z Z,Huang S X,et al.Whole transcriptome sequencing reveals genes involved in plastid/chloroplast division and development are regulated by the HP1/DDB1 at an early stage of tomato fruit development[J].Planta,2013,238:923-936.

[14]Liu J K,Gao Y F,Niu X L,et al.Construction and transformation of co-RNAi vector of tomato HP1 and HP2 genes[J].Chin J Appl Environ Biolm,2009,15:591-595.

[15]Pemg Y S,Liu E.Studies of method on extract chlorophyll a and b[J].Journal of China Agricultural University,1992,18:247-250.

[16]Meng F J,Xu X Y,Li J F.Study on correlation of the tomato fruit’s pigment content and surface colour[J].J Northeast Agric Univ,2006,37:459-462.

[17]Wang S H,Liu J K,Feng Y Y,et al.Altered plastid levels and potential for improved fruit nutrient content by downregulation of the tomato DDB1-interacting protein CUL4[J].The Plant Journal,2008,55:89-103.

(責(zé)任編輯閆杏麗)

Tomato de-ubiquitination enzymes AMSH3 gene improving tomato quality

LIU Yan-hong,LI Guang-wei,LIU Yong-sheng

(School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:AMSH3 enzyme is a member of de-ubiquitination enzymes in MPN(+)/JAMM protease family,which can bind ubiquitinated protein ubiquitin molecule.The similarities of the de-ubiquitination enzyme gene SlAMSH3 in tomato were 81% and 71% in nucleic acid and protein levels in comparison with AtAMSH3 enzyme gene in Arabidopsis thaliana.In Arabidopsis,the formation of vacuole and the pathway to transport vacuole protein are affected by de-ubiquitination enzymes AMSH3.In this paper,the SlAMSH3 fruit-specific overexpression vector was constructed and transferred into tomato plants through a reproducible agrobacterium-mediated transformation.The transgenic plants expressing SlAMSH3 highly in fruit were confirmed by screening.The analysis result of fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)showed that the expression quantity of SlAMSH3 increased in the transgenic plants compared to that of wild type plants.The chlorophyll concentration of the positive tomato at green ripe stage and the single fruit weight,brix content,firmness,lycopene concentration and β-carotene concentration of the fruit at red ripe stage were determined.The chlorophyll concentration,lycopene,β-carotene in the transgenic tomato fruit were improved 178.61%,40.53% and 74.86% respectively,while other indicators showed no significant differences.Therefore,fruit-specific overexpression of tomato SlAMSH3 is a useful genetic engineering approach to improve fruit quality.

Key words:AMSH3 gene;fruit-specific overexpression;genetic transformation;transgenic tomato;fruit quality improvement

收稿日期：2015-01-03；修回日期：2015-04-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171179)

作者簡(jiǎn)介：劉艷紅(1989-),女,河南周口人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;劉永勝(1964-),男,重慶市人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.023

中圖分類號(hào):Q785;S641.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-5060(2016)04-0548-06