孫傳波+郭嘉+袁英

摘要：以玉米（Zea mays L.）HiII的幼胚為外植體，β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）為報(bào)告基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化體系的外植體大小、農(nóng)桿菌濃度、熱預(yù)處理溫度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)及恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間、抗生素、篩選劑等因素進(jìn)行優(yōu)化，以建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，幼胚大小為1.0～1.5 mm，農(nóng)桿菌菌液的OD600 nm為0.5，40 ℃熱處理3 min，侵染8 min，共培養(yǎng)3 d和恢復(fù)培養(yǎng)4 d，100 mg/L羧芐青霉素作為抑菌劑，雙丙氨膦作為篩選劑時(shí)為最佳遺傳轉(zhuǎn)化條件。通過該優(yōu)化體系已獲得多種轉(zhuǎn)基因玉米材料，表明該體系具有較高的可重復(fù)性和可靠性。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法;玉米（Zea mays L.）;幼胚;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S513;Q789 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）12-2743-04

Establishing Genetic Transformation System of Maize Immature Embryos Mediated by Agrobacterium tumefaciens

SUN Chuan-bo，GUO Jia，YUAN Ying

（Agro-Biotechnology Research Institute， Jilin Academy of Agriculture Sciences， Changchun 130033，China）

Abstract： In order to establish genetic transformation system of maize immature embryos mediated by Agrobacterium tumefaciens， factors including size of explants， concentration of Agrobacterium tumefaciens， temperature of thermal pretreatment， infection time， cultivation and recovery time， antibiotics， screening agent affecting genetic transformation system were optimized using immature embryos of HiII as explants and GUS as reporter gene. The results showed that the size of the embryos was 1.0 to 1.5 mm in length. The OD600 nm of Agrobacterium was adjusted to 0.5 before inoculation. Pretreatment was 3 min at 40 ℃. Infection time was 8 min. It was co-cultivated 3 days and rested 4 days. 100 mg/L carbenicillin was used to eliminate Agrobacterium and bialaphos was used as selective agent. Transgenic plants were obtained by the optimized system， which was a highly and reliable system.

Key words： Agrobacterium tumefaciens-mediated method; maize（Zea mays L.）; immature embryos; genetic transformation

玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物和工業(yè)原料作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中具有重要戰(zhàn)略地位。利用基因工程技術(shù)手段創(chuàng)制性狀優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因玉米新種質(zhì)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義，為玉米育種技術(shù)開辟了新途徑。自1988年Rhodes等[1]首次獲得轉(zhuǎn)基因玉米完整植株，1996年Ishida等[2]初步建立農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系以來，玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究得到了迅速發(fā)展，目前已有多種轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化生產(chǎn)。玉米遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法、合子轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法最為常用[3-5]，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法因具有外源基因整合位點(diǎn)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化機(jī)理清楚、轉(zhuǎn)基因后代拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)而更受青睞[6]。研究表明基因型和外植體是影響玉米遺傳轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素[7]，目前成功的基因型材料多為玉米A188和HiII，而幼胚因再生能力明顯高于其他部位而被廣泛應(yīng)用。建立穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是研究轉(zhuǎn)基因玉米的關(guān)鍵，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化方法和受體已建立了多種體系，并獲得了抗除草劑、抗蟲、抗病、抗寒和抗旱等多種轉(zhuǎn)基因種質(zhì)材料[7-15]。

本研究以具有高再生能力的玉米HiII幼胚為外植體，探索外植體大小、農(nóng)桿菌濃度、熱預(yù)處理溫度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)及恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間、抗生素、篩選劑等因素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，通過β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）瞬時(shí)表達(dá)率分析優(yōu)化各因素，集合各優(yōu)化因子建立高效穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，為轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化平臺(tái)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?植物材料 ?玉米HiII。

1.1.2 ?植物表達(dá)載體和菌株 ?植物表達(dá)載體為pCAMBIA3301，菌株為農(nóng)桿菌EHA105。

1.1.3 ?培養(yǎng)基及成分 ?侵染培養(yǎng)基（IM）：1/2 MS鹽+1/2 MS維生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+200 μmol/L AS+36 g/L蔗糖+68 g/L葡萄糖，pH 5.2;繼代培養(yǎng)基（M）：MS鹽+MS維生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L L-脯氨酸+200 mg/L L-天門冬酰胺+1.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂，pH 6.0;共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CM）：繼代培養(yǎng)基+100 μmol/L AS+850 mg/L AgNO3，pH 6.0;恢復(fù)培養(yǎng)基1（RM1）：繼代培養(yǎng)基+0.5 g/L MES+100 mg/L Car，pH 6.0;恢復(fù)培養(yǎng)基2（RM2）：繼代培養(yǎng)基+0.5 g/L MES+250 mg/L Cef，pH 6.0;選擇培養(yǎng)基1（SM1）：繼代培養(yǎng)基+1.5 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;選擇培養(yǎng)基2（SM2）：繼代培養(yǎng)基+3.0 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;分化培養(yǎng)基（FM）：繼代培養(yǎng)基+0.5 mg/L KT，pH 6.0; 生根培養(yǎng)基（GM）：繼代培養(yǎng)基+0.5 mg/L IBA+5 g/L活性炭;YEB培養(yǎng)基：10 g/L酵母提取物+10 g/L蛋白胨+5 g/L NaCl，pH 7.0。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體制備 ?取授粉9～12 d左右的雌穗，剝?nèi)グ~，將頂端切去1 cm左右后浸泡在70%乙醇中，15 min后取出并用無(wú)菌水洗凈，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)∮着?，幼胚大?.5～2.0 mm，置于含有1.5 mL IM的EP管中備用，每管中含有50多個(gè)大小相同的幼胚。

1.2.2 ?外植體遺傳轉(zhuǎn)化

1）工程菌制備。將保存于-80 ℃冰箱中的農(nóng)桿菌于YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)至長(zhǎng)出直徑約 1 mm大小的單菌落，經(jīng)分子驗(yàn)證后重新在YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，19 ℃培養(yǎng)3 d后收集菌體，用IM懸浮，加入乙酰丁香酮（AS）至終濃度為200 μmol/L，并制備成不同濃度的工程菌備用。

2）外植體侵染。制備的幼胚，一部分經(jīng)過不同溫度水浴熱處理3 min后立刻冰浴1 min再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一部分直接用于轉(zhuǎn)化。工程菌液的OD600 nm分別為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0，侵染時(shí)間分別為2、5、8、11、14 min，侵染結(jié)束后，棄掉菌液，將幼胚置于滅菌的濾紙上，吸去多余菌液，轉(zhuǎn)移到CM中，整個(gè)過程不能傷害幼胚。

1.2.3 ?共培養(yǎng)及恢復(fù)培養(yǎng) ?轉(zhuǎn)化后的幼胚置于CM中，21 ℃暗培養(yǎng)1～5 d。共培養(yǎng)后的幼胚，一部分轉(zhuǎn)移到RM1中，一部分轉(zhuǎn)移到RM2中，經(jīng)過4 d的恢復(fù)培養(yǎng)，其他的不經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)，直接轉(zhuǎn)移到SM中進(jìn)行篩選。

1.2.4 ?抗性愈傷組織的篩選 ?恢復(fù)培養(yǎng)后的幼胚轉(zhuǎn)移到SM1中，經(jīng)過14 d的篩選后轉(zhuǎn)移到SM2中，經(jīng)過3輪篩選，每輪篩選時(shí)間為14 d，最后得到抗性愈傷組織。

1.2.5 ?轉(zhuǎn)化植株的獲得及檢測(cè)

1）轉(zhuǎn)化植株的獲得。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到FM和GM中，經(jīng)過分化和生根培養(yǎng)后獲得轉(zhuǎn)化植株。

2）GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。幼胚用磷酸緩沖液清洗后置于GUS染色液中，37 ℃溫浴24 h，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)帶有藍(lán)斑的幼胚，并計(jì)算GUS瞬時(shí)表達(dá)率。GUS瞬時(shí)表達(dá)率=（有藍(lán)斑幼胚/侵染幼胚）×100%。

3）轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)。提取轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA[8]，進(jìn)行Bar和目的基因的PCR檢測(cè)。取1 cm左右PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株葉片，按照試紙條檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ?外植體大小對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

幼胚的大小直接影響遺傳轉(zhuǎn)化效果，試驗(yàn)中將幼胚大小分為0.5～1.0 mm、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm 3類，用OD600 nm為0.5的菌液侵染8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，幼胚大小為1.0～1.5 mm的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，為12.08%，明顯高于其他幼胚的GUS瞬時(shí)表達(dá)率，因此選擇1.0～1.5 mm的幼胚作為受體材料。

2.2 ?農(nóng)桿菌濃度（OD600 nm）對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

用OD600 nm分別為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)OD600 nm為0.5和0.6時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率較高，二者相差很小，但高濃度的農(nóng)桿菌對(duì)幼胚傷害較大，并影響后期的愈傷誘導(dǎo)，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇農(nóng)桿菌菌液OD600 nm為0.5。

2.3 ?熱預(yù)處理溫度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

在幼胚侵染前，將浸泡在IM中的幼胚采用35、40、45、50 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著熱處理溫度升高，GUS瞬時(shí)表達(dá)率先升高后降低，40 ℃時(shí)最高，50 ℃時(shí)較低，可能是溫度太高對(duì)幼胚造成了巨大傷害，有些幼胚甚至死亡，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇40 ℃熱處理3 min。

2.4 ?侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

以40 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液分別侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體2、5、8、11、14 min，21 ℃共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行GUS檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化體系的影響也很大，侵染8 min的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，侵染5 min和11 min兩者的GUS瞬時(shí)表達(dá)率差別不大，但是后期的幼胚培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，侵染11 min比侵染5 min的農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重，而且幼胚生長(zhǎng)狀態(tài)不好，且不容易分化，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇侵染時(shí)間為8 min。

2.5 ?共培養(yǎng)時(shí)間和恢復(fù)培養(yǎng)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

以40 ℃水浴熱處理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm為0.5的菌液侵染幼胚大小為1.0～1.5 mm的外植體8 min，21 ℃共培養(yǎng)1～5 d后直接進(jìn)行GUS檢測(cè)或再恢復(fù)培養(yǎng)4 d后進(jìn)行GUS檢測(cè)，考察共培養(yǎng)時(shí)間和恢復(fù)培養(yǎng)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，共培養(yǎng)3 d的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，恢復(fù)培養(yǎng)4 d比無(wú)恢復(fù)培養(yǎng)的瞬時(shí)表達(dá)率明顯升高，因此選擇共培養(yǎng)3 d和恢復(fù)培養(yǎng)4 d。

2.6 ?抗生素和篩選劑對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

抗生素在抑制農(nóng)桿菌的同時(shí)也影響轉(zhuǎn)化率，在恢復(fù)培養(yǎng)基中分別加入100 mg/L Car或250 mg/L Cef來抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，結(jié)果表明，羧芐青霉素（Car）作為抑菌劑明顯好于噻孢霉素（Cef），同時(shí)對(duì)于幼胚生長(zhǎng)的影響也小于Cef。

在選擇培養(yǎng)基中分別使用雙丙氨膦（Bialaphos）和草胺膦（Glufosinate）為篩選劑，經(jīng)雙丙氨膦篩選的后代假陽(yáng)性率低于10%，而草胺膦篩選的后代假陽(yáng)性率高達(dá)70%，因此選擇雙丙氨膦作為篩選劑。

2.7 ?高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

集合各優(yōu)化因子，即幼胚大小為1.0～1.5 mm，農(nóng)桿菌菌液的OD600 nm為0.5，40 ℃熱處理3 min，侵染8 min，共培養(yǎng)3 d和恢復(fù)培養(yǎng)4 d，100 mg/L羧芐青霉素作為抑菌劑，雙丙氨膦作為篩選劑，建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系3次試驗(yàn)的GUS瞬時(shí)表達(dá)率平均為32.26%，明顯高于未優(yōu)化體系（CK）的11.90%（表1）。

2.8 ?轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)

對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株初步采用PCR檢測(cè)方法，經(jīng)Bar基因PCR檢測(cè)，1～9號(hào)轉(zhuǎn)基因材料全部為陽(yáng)性;經(jīng)目的基因PCR檢測(cè)，1～8號(hào)轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性（圖6）。通過Bar試紙條進(jìn)行蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，3、6、7、8、9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性，有非常清晰的檢測(cè)線出現(xiàn)（圖7）。

3 ?結(jié)論

在玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究中，外植體的類型有很多種，幼胚因易轉(zhuǎn)化、再生能力強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用，幼胚的大小直接影響遺傳轉(zhuǎn)化率，本研究證明幼胚大小在1.0～1.5 mm時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，為12.08%，該結(jié)果和國(guó)內(nèi)外很多研究結(jié)果相符[13-16]。高濃度菌液、長(zhǎng)時(shí)間侵染對(duì)幼胚的傷害較大，在不影響遺傳轉(zhuǎn)化率的情況下，盡量選擇低濃度、短時(shí)間侵染，本研究證明菌液OD600 nm為0.5、侵染8 min時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。對(duì)比已建立的以胚性愈傷組織為外植體的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系[17]，菌液OD600 nm要小0.1，侵染時(shí)間要減少7 min。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中共培養(yǎng)3 d后采取4 d的恢復(fù)培養(yǎng)，讓轉(zhuǎn)化材料盡早適應(yīng)篩選環(huán)境，可明顯提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率。本研究對(duì)幼胚材料進(jìn)行40 ℃熱預(yù)處理3 min，GUS瞬時(shí)表達(dá)率提高1倍多，與Hiei等[18]的研究結(jié)果相比略微不同，可能是受體材料基因型不同造成的，熱處理還需要更廣泛的試驗(yàn)來證明。抑菌劑不僅影響幼胚的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)還影響遺傳轉(zhuǎn)化率，Car作為抑菌劑明顯優(yōu)于Cef，該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道吻合[10]。在整個(gè)篩選過程中，采用雙丙氨膦作為篩選劑和采用傳統(tǒng)的草胺膦相比，大大降低了假陽(yáng)性率。集合各優(yōu)化因子建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，基于該體系已獲得多種轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)，分子檢測(cè)結(jié)果證實(shí)該體系具有穩(wěn)定的可重復(fù)性和高效性。該體系的建立豐富了玉米種質(zhì)資源，開拓了玉米育種途徑。

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