李紅衛(wèi),王開萍,吳　娛,唐正江,湯　飛,劉國(guó)慶,2

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥　230009;2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城　242000)

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豬肌肉組織中堿性磷酸酶的純化及特性研究

李紅衛(wèi)1,王開萍1,吳娛1,唐正江1,湯飛1,劉國(guó)慶1,2

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009;2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城242000)

摘要:豬肌肉組織中堿性磷酸酶經(jīng)預(yù)冷的正丁醇提取、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-52纖維素離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析得到堿性磷酸酶。純化倍數(shù)為57.34,比活力為28.77 U/mg。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分析可得該酶的分子質(zhì)量為66 kDa。該酶催化底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)的最適pH值為9.7,最適溫度為30℃，Mg2+和Ca2+對(duì)其有激活作用,Zn2+和EDTA對(duì)其有抑制作用。

關(guān)鍵詞:豬肌肉組織;堿性磷酸酶;分離純化

堿性磷酸酶(AKP)是一種同源二聚體的糖蛋白,該酶屬于磷酸酶,在堿性條件下(最適pH值為10左右)能夠通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去,產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和對(duì)應(yīng)的醇、酚或糖。AKP不僅參與鈣磷代謝,維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例,而且還與蛋白的分泌與合成相關(guān),在生物體的物質(zhì)代謝中具有重要作用[1-2]。近年來(lái),很多研究者從不同動(dòng)物組織中分離純化出了堿性磷酸酶[3-5],并對(duì)其性質(zhì)做了大量的研究。文獻(xiàn)[6]從雞肝中分離純化了雞肝堿性磷酸酶,以對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)為底物,測(cè)得該酶的最適pH值為10.5,最適溫度為40℃。甲醇、乙二醇與丙三醇均對(duì)其活性有不同程度的抑制作用。文獻(xiàn)[7]從鴨肝中分離純化出電泳純的堿性磷酸酶,該酶純化倍數(shù)達(dá)58.3倍,比活力為337.4 U/mg。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和凝膠過濾測(cè)得該酶的亞基分子量為60.5 kDa；以磷酸苯二鈉為底物,測(cè)得該酶的最適pH值為9.0,最適溫度為40℃；Na+、K+、Li+等一價(jià)離子對(duì)該酶活性基本無(wú)影響,Mg2+、Mn2+對(duì)該酶活性有激活作用,Cd2+對(duì)該酶活性有抑制作用。文獻(xiàn)[8]從牛小腸中分離純化出牛小腸堿性磷酸酶,提純倍數(shù)為50.69,比活力為48.87 U/mg;經(jīng)SDS-PAGE呈現(xiàn)單一條帶;該酶催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)水解反應(yīng)的最適pH值為9.7,pH值小于6.5大于11.5均不穩(wěn)定;最適溫度為45℃,高于50℃不穩(wěn)定;利用SDS-PAGE測(cè)定酶亞基的分子量為66 kDa;Mg2+、Mn2+和Ca2+對(duì)酶有不同程度的激活作用,Zn2+和EDTA對(duì)酶有抑制作用。文獻(xiàn)[9]分離純化番鴨小腸中堿性磷酸酶,并對(duì)其酶促動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,該酶催化磷酸苯二鈉水解反應(yīng)時(shí)最適溫度為45℃,最適pH值為9.7;Mg2+對(duì)堿性磷酸酶活性有明顯激活作用;Cd2+質(zhì)量濃度小于0.4 mg/L時(shí)對(duì)堿性磷酸酶有激活作用,而質(zhì)量濃度高于0.4 mg/L時(shí)則有抑制作用;Cu2+對(duì)堿性磷酸酶活性有明顯抑制作用。

不同來(lái)源的堿性磷酸酶提取方法和特性存在差異性,目前關(guān)于豬肉中堿性磷酸酶分離純化的相關(guān)報(bào)道不多,本文旨在建立豬肌肉組織中堿性磷酸酶分離純化方法,并進(jìn)一步探討該酶的相關(guān)特性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

豬(Sus domesticus)肌肉組織采自安徽省春然食品有限公司屠宰基地(合肥)健康活豬豬背最長(zhǎng)肌,采用無(wú)菌薄膜包裝后置于0～4℃冷卻貯藏。

1.1.2試劑

DEAE-纖維素(DEAE-52)和丙烯葡聚糖凝膠S-200(Sephacryl S-200)購(gòu)于GE Healthcare公司;丙烯酰胺(電泳級(jí))、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨,購(gòu)于sigma公司;牛血清白蛋白(BSA),購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司;對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP),購(gòu)于天津億鑫化工有限公司;正丁醇、氯仿、碳酸氫鈉、碳酸鈉、甘氨酸、HCl、EDTA、NaCl、NaOH、硫酸銨固體、BaCl2、考馬斯亮藍(lán),均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2×蛋白質(zhì)電泳loading buffer,購(gòu)于北京天根生物公司;蛋白質(zhì)marker,購(gòu)于TaKaRa(大連)公司。

1.2儀器與設(shè)備

AR1140型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)、臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、CR22G型高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)、721E型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、HH-2孔數(shù)顯水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)、凝膠電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、層析柱(16 mm×600 mm)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、PHSCAN10型pH計(jì)(METER公司)、ULT-487型超低溫冰箱(美國(guó)Revco公司)、超聲波清洗儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)、BSZ-100電腦自動(dòng)部分收集器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、GmbH紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Biostep公司)。

1.3方法

1.3.1堿性磷酸酶的分離純化

參考文獻(xiàn)[10]的方法并加以修改。稱取100 g豬肉用蒸餾水漂洗干凈,清除結(jié)締組織和脂肪后剪碎,與預(yù)冷的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液(含0.02 mol/L NaCl,pH值為7.5)按每克豬肉加入3 mL緩沖液的比例混合,研磨均勻,置4℃冰箱中抽取1 h。將勻漿液離心(4℃,10 000 r/min,15 min),取上清,加入1/5體積預(yù)冷的正丁醇,4℃抽提過夜進(jìn)行除脂。次日,離心(4℃,10 000 r/min,15 min),取其中清液加入硫酸銨固體至飽和度為0.35,4℃冰箱靜置4 h后離心(4℃,10 000 r/min,20 min),取其中清液并加入固體硫酸銨至飽和度為0.65,4℃冰箱中靜置4 h，然后離心,取固相。

將固相溶于0.05 mol/L Tris-HCl(pH值為 7.5,下同)緩沖液中,用蒸餾水透析脫鹽至透析水，加入BaCl2無(wú)白色沉淀為止。將蛋白于4℃ 10 000 r/min離心20 min,取上清液測(cè)定蛋白濃度及酶活力。

透析后取樣液5 mL過DEAE-52纖維素柱,用含0～1.0 mo1/L NaCl的Tris-HCl作梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,每管收集5 mL,在280 nm分別測(cè)定各管的蛋白質(zhì)濃度和AKP 酶活力。合并活力峰附近的幾管后,透析,冷凍干燥濃縮。

取蛋白酶250 mg溶于5 mL的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液中,過Sephacryl S-200凝膠過濾柱,以0.1 mol/L的NaCl溶液(含0.05 mol/mL Tris-HCl)為洗脫液,洗脫流速為0.3 mL/min,每管3 mL,分別測(cè)定各管蛋白質(zhì)濃度和AKP酶活力,收集活力峰,透析,濃縮,得純化樣品。

1.3.2酶活力的測(cè)定

采用以p-NPP為底物的金氏法[11]測(cè)定其酶活力,并在該方法規(guī)定的條件下,定義每15 min生成1 μmol酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.3蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

采用Bradford法[12]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.4SDS-PAGE

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定,分離膠體積分?jǐn)?shù)為10%,濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為10%;考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.5堿性磷酸酶特性研究

(1)最適pH值及其酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定。將3 mL不同pH值的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL的蛋白質(zhì)酶液,在37℃預(yù)熱5 min,加入緩沖液的復(fù)合基質(zhì)液1.9 mL(1.8 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH值為9.5)緩沖液中加入0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,37℃預(yù)熱10 min),置于37℃恒溫10 min,接著加入1.0 mL堿性溶液終止反應(yīng),測(cè)定每管的酶活力。以pH值為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)繪制pH值-活性曲線,求出堿性磷酸酶的最適pH值。

將1.8 mL不同pH值的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL的蛋白質(zhì)酶液,在37℃預(yù)熱1 h,再加入0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,混勻,置于37℃恒溫10 min,接著加入1.0 mL堿性溶液終止反應(yīng),測(cè)定每管的酶活力。對(duì)照樣則在加入p-NPP之前先加入1.0 mL堿性溶液。以pH值為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)繪制酸堿穩(wěn)定曲線,并分析堿性磷酸酶的酸堿穩(wěn)定范圍。

(2)最適溫度及其熱穩(wěn)定性的測(cè)定。參考上述方法。采用pH值為9.7的緩沖液,溫度分別設(shè)定為10、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃,保溫10 min,測(cè)定酶活力。以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活為縱坐標(biāo),繪制溫度-活性曲線,并求出堿性磷酸酶的最適溫度。

采用pH值為9.7的緩沖液,將3 mL緩沖液、0.1 mL的蛋白質(zhì)酶液,0.1 mL 20 mmol/L p-NPP,熱處理溫度分別為0、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃,熱處理時(shí)間為30 min后,立即以流動(dòng)水冷卻并置于37℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱2 min,37℃預(yù)熱的復(fù)合基質(zhì)液各加1.9 mL,37℃精確反應(yīng)10 min,各加1.0 mL堿性溶液終止反應(yīng),測(cè)定酶活。以處理溫度為橫坐標(biāo),相對(duì)酶活為縱坐標(biāo),繪制熱穩(wěn)定曲線,并分析堿性磷酸酶的熱穩(wěn)定范圍。

1.3.6金屬離子及EDTA對(duì)AKP酶活的影響

在酶最適溫度與pH值下,在1.8 mL 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液、0.1 mL蛋白質(zhì)酶液中,分別加入0.2 mL 20 mmol/L MgCl2、ZnCl2、EDTA、CaCl2及0.2 mL蒸餾水,37℃預(yù)熱5 min,再加入0.1 mL 37℃預(yù)熱p-NPP,37℃精確反應(yīng)10 min,各加1.0 mL堿性溶液終止反應(yīng),測(cè)酶活力,分析其對(duì)AKP酶活的影響。

2結(jié)果與分析

2.1AKP酶的純化

將豬肉經(jīng)過預(yù)冷正丁醇的處理、硫酸銨分級(jí)分離、離心、透析等步驟處理后的粗酶液,經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱層析得到多組分蛋白,過Sephacryl S-200凝膠柱層析得到多組分蛋白，分別留樣測(cè)定蛋白濃度和活性。計(jì)算出總蛋白質(zhì)量、總活力、比活力和純化倍數(shù)，見表1所列。

表1　豬肌肉組織中AKP的分離純化

2.2DEAE-52離子交換層析

將粗酶液溶解于0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液,經(jīng)以0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液平衡過的DEAE-52離子交換層析柱(16 mm×600 mm)，通過0～1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫,結(jié)果如圖1所示。

圖1中管數(shù)以每管吸取0.5 mL計(jì)算，由圖1可知，主要有2個(gè)活力峰,其中第1個(gè)峰主要在第15～17管區(qū)域,第2個(gè)峰在第29～31管區(qū)域。由于第2個(gè)峰在0.6 mol/L的NaCl緩沖液洗脫的梯度下于280 nm處,測(cè)得較高的光密度值,同時(shí)酶活力也明顯高于第1個(gè)峰,故將第29～31管酶液收集于一管,經(jīng)低溫冷凍干燥濃縮后待用。

圖1　AKP的DEAE-52離子交換層析圖

2.3Sephacryl S-200凝膠過濾層析

經(jīng)上述純化的酶溶解于0.05 mol/L的Tris-HCl的平衡緩沖液,經(jīng)該平衡緩沖液平衡過的Sephacryl S-200層析柱(16 mm×600 mm)，通過0.1 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫，結(jié)果如圖2所示。圖2中，管數(shù)以每管吸取0.4 mL計(jì)算。圖2中出現(xiàn)了2個(gè)主要的活力峰,第1個(gè)在第14～16管區(qū)域,第2個(gè)在第34～36管區(qū)域,再比較2個(gè)活力峰區(qū)域的光密度值,第2個(gè)峰明顯高于第1個(gè)峰,故收集第34～36管的酶液于一管中,低溫冷凍干燥濃縮得到酶純品。

圖2　AKP的Sephadex S-200 凝膠過濾層析

2.4SDS-PAGE電泳圖

取經(jīng)Sephacryl S-200凝膠過濾純化的酶,通過SDS-PAGE電泳得到的電泳如圖3所示。

1.堿性擴(kuò)增　2.蛋白質(zhì)marker

圖3中，第1列為純化后的樣品；第2列為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，分別為:肌球蛋白(200 kDa)、β-半乳糖苷酶(116 kDa)、磷酸酶b(97.2 kDa)、牛血清蛋白(66.4 kDa)、卵清蛋白(44.3 kDa)、碳酸苷酶(29.0 kDa)、胰蛋白酶抑制劑(20.1 kDa)、溶菌酶(14.3 kDa)、抑肽酶(6.5 kDa)。從圖3可以看出,純化后的結(jié)果顯現(xiàn)出單一區(qū)帶,說明該酶已達(dá)到電泳純，AKP的分子量大約為66 kDa。

2.5最適pH值測(cè)定及其酸堿穩(wěn)定性

pH值對(duì)AKP活力的影響如圖4所示,從圖4可知,在pH值小于9.5的情況下,酶活力隨pH值的增加而上升；在其大于10時(shí),酶活力隨pH值的增大而下降。酶在pH值為9.0～11.0時(shí)活力較高,在pH值為9.7時(shí)活力最高,所以最適pH值為 9.7。

圖4　pH值對(duì)AKP活力的影響

pH值對(duì)AKP穩(wěn)定性的影響如圖5所示。由圖5可得,酶在pH值為7.0～10.5時(shí)酶活力變化不大,在該范圍之外酶活力變化劇烈,說明在pH值為7.0～10.5時(shí)較穩(wěn)定。

圖5　pH值對(duì)AKP穩(wěn)定性的影響

2.6最適溫度及其熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)AKP活力的影響如圖6所示。從圖6可知,在溫度高于30℃時(shí),酶活力隨溫度的增大而下降;在低于30℃時(shí),酶活力隨溫度的增大而上升。AKP在30℃時(shí)酶的活力最高,說明其最適溫度為30℃。

溫度對(duì)AKP穩(wěn)定性的影響如圖7所示,由圖7可知,當(dāng)溫度高于40℃時(shí),酶活力明顯下降,說明酶高于40℃不穩(wěn)定,易變性失活。

圖6　溫度對(duì)AKP活力的影響

圖7　溫度對(duì)AKP穩(wěn)定性的影響

2.7金屬離子及EDTA對(duì)AKP 酶活力的影響

Mg2+、Zn2+、Ca2+、EDTA 、H2O的相對(duì)酶活分別為120%、74%、135%、49%、100%,說明EDTA對(duì)AKP有較強(qiáng)的抑制作用,Mg2+和Ca2+對(duì)AKP有明顯的激活作用,而Zn2+對(duì)AKP有抑制作用。

3討論

本文通過正丁醇對(duì)樣品的粗提、硫酸銨的分級(jí)分離得到粗蛋白酶,再經(jīng)過離子交換層析、凝膠過濾等技術(shù)手段,從豬肌肉組織中純化出堿性磷酸酶。

經(jīng)SDS-PAGE電泳得到豬肌肉組織AKP分子量為66 kDa左右,與牛小腸的66 kDa、南方鲇[13]的66.2 kDa大致相同,而鴨肝AKP分子量為60.5 kDa,大涼疣螈[14]為48.41 kDa,大腸桿菌[15]為40 kDa,家蠶[16]約為55 kDa,從而證明了不同種屬的AKP的大小不同。純化倍數(shù)達(dá)57.34倍,與鴨肝的58.3倍、牛小腸的50.69倍大致相似，而比背角無(wú)齒蚌19倍[17]、白蠟蟲16.8倍[18]、瘦肉型(PIC344)精液11.5倍[19]、大腸桿菌18.8倍[20]均有較大提高,說明該方法可有效純化豬肌肉組織。

AKP的性質(zhì)因動(dòng)物物種的種屬不同而不同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,豬肌肉組織中AKP的最適溫度為30℃,而牛小腸中AKP和合浦珠母貝[20]的為45℃,雞肝AKP的為40℃,差異較明顯。豬肌肉組織AKP最適pH值為9.7,與合浦珠母貝和牛小腸相同、與背角無(wú)齒蚌pH值相近,與其他動(dòng)物則有明顯的差異,說明不同種類動(dòng)物AKP的性質(zhì)不同。

EDTA對(duì)堿性磷酸酶有較強(qiáng)的抑制作用,證明豬肉中堿性磷酸酶是一種金屬酶[21],金屬離子對(duì)維持其分子結(jié)構(gòu)和催化活性均有重要作用,研究不同金屬離子的影響,對(duì)于探討AKP的作用機(jī)理,調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝等具有一定意義。Mg2+和Ca2+對(duì)AKP有明顯的激活作用,此類離子應(yīng)該為豬肌肉AKP的有益離子,而Zn2+對(duì)AKP有抑制作用,當(dāng)濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí),酶活力就開始有所下降。因此,AKP作為一種重要的調(diào)節(jié)酶參與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,研究金屬離子與該酶活力的關(guān)系,有利于選擇合適的金屬離子作為飼料添加劑,這樣在保證動(dòng)物產(chǎn)品食用安全的情況下,有利于提高經(jīng)濟(jì)效益,因而對(duì)于肉豬飼料的改進(jìn)值得進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

Purification and properties of alkaline phosphatase from pig muscle tissue

LI Hong-wei1,WANG Kai-ping1,WU Yu1, TANG Zheng-jiang1,TANG Fei1,LIU Guo-qing1,2

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China;2.Anhui Wan Jiang Poultry Industry Research Institute,Xuancheng 242000,China)

Abstract:Alkaline phosphatase(AKP)from pig muscle tissue was extracted by the cold n-butanol and precipitated with ammonium sulfate,ion-exchange chromatography was made with DEAE-52 cellulose column and gel filtration chromatography through Sephacryl S-200.The purification multiple was 57.34,and the specific activity was 28.77 U/mg.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)result showed a single band with the relative molecular mass of 66 kDa.The optimum pH value for the enzyme to catalyze the hydrolysis of phenylphosphonic acid disodium salt(p-NPP)was 9.7 and the optimum temperature was 30℃.Mg2+and Ca2+could activate the enzyme while Zn2+and EDTA inhibit it.

Key words:pig muscle tissue;alkaline phosphatase(AKP);seperation and purification

收稿日期：2015-01-09；修回日期：2015-03-10

基金項(xiàng)目：安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(1401032006)

作者簡(jiǎn)介：李紅衛(wèi)(1988-),男,安徽宿州人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;劉國(guó)慶(1963-),男,安徽蕪湖人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師.

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.04.025

中圖分類號(hào):Q814.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1003-5060(2016)04-0560-06