仲義+王云鵬+代秀云+劉文國(guó)

摘要：從甲磺隆抗性結(jié)縷草植株中克隆得到乙酰乳酸合成酶基因（ALS），構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的該基因的植物表達(dá)載體p33-ALS。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米萌動(dòng)胚轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化玉米種子，獲得抗除草劑的轉(zhuǎn)ALS基因玉米材料。結(jié)果表明，經(jīng)除草劑篩選共獲得抗性植株7株，陽(yáng)性率為1.4%，T1代植株除草劑抗性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株能夠耐受住5%的甲磺隆溶液噴灑。分離得到的ALS基因?qū)胗衩谆蚪M后能夠極大地提高對(duì)甲磺隆的耐受能力。

關(guān)鍵詞：玉米；萌動(dòng)胚；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S513；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）17-4001-04

Generating Herbicide Resistant Transgenic Plants in Maize with

Germinating Embryo as Explants

ZHONG Yi1， WANG Yun-peng2， DAI Xiu-yun1， LIU Wen-guo2

（1. Maize Research Institute， Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 2. College of Agriculture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract： The plant expression vector p33-ALS driven by 35S promoter was constructed from the resistance of a short cycling zoysia plants originated from cloning ALS gene. The genetically modified maize with herbicide resistance ALS gene was obtained with agrobacterium mediated transformation of stirring of maize embryo into maize seeds. The results showed that the positive rate of the resistant 7 plants filtrated by way of herbicide was 1.4%. Herbicide resistance of the T1 generation plant showed that the transgenic plants tolerated a solution spray with 5% metsulfuron-methyl. The ALS gene isolated from this study after transferred into maize genome can greatly improve maize tolerance of metsulfuron-methyl.

Key words： maize； germinating embryo； agrobacterium tumefaciens； genetic transformation

雜草是危害農(nóng)作物的主要生物脅迫之一，盡管其對(duì)玉米生長(zhǎng)中后期不再產(chǎn)生影響，但早期仍需要進(jìn)行除草。除草劑是玉米除草十分理想的選擇，盡管已有玉米專用性除草劑出現(xiàn)，但是對(duì)于多數(shù)單子葉雜草，其效果仍不理想，并且與草丁膦抗性相關(guān)的bar基因、與草甘膦抗性的EPSPS基因等許多除草劑基因均已被國(guó)外育種公司注冊(cè)并取得了專利保護(hù)，成為我國(guó)育種過程中進(jìn)一步應(yīng)用的障礙。乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸合成途徑的第一種酶，不同的ALS的氨基酸序列的差異與磺酰脲類除草劑抗性具有很大的關(guān)系，多數(shù)植物的ALS對(duì)磺酰脲類除草劑較為敏感，目前已在擬南芥、細(xì)菌等中對(duì)此基因進(jìn)行了克隆并對(duì)氨基酸序列和除草劑抗性的關(guān)系進(jìn)行了研究[1，2]，但相關(guān)的專利保護(hù)不像bar基因、EPSPS基因那樣苛刻。

利用農(nóng)桿菌侵染及基因槍轟擊等方法對(duì)玉米不同來(lái)源的外植體，諸如懸浮細(xì)胞[3]、幼胚[4]、幼穗[5，6]、莖尖[7-9]、成熟胚[10，11]等進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化方法往往需要消耗大量人力物力并有一定的基因型依賴性。由于適合進(jìn)行組織培養(yǎng)的基因型不具備較好的農(nóng)業(yè)性狀，因此給進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因玉米新品種選育工作帶來(lái)較多阻礙。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚[12，13]能夠較好地解決這一問題，因此適合針對(duì)農(nóng)藝性狀好但組織培養(yǎng)體系尚未建立的玉米自交系的遺傳轉(zhuǎn)化工作。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚的方法將克隆的ALS基因轉(zhuǎn)化到玉米基因組中，分析轉(zhuǎn)基因后對(duì)除草劑甲磺隆的抗性，為創(chuàng)建抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新品種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：JVO16為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所實(shí)驗(yàn)室保存。結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）種子購(gòu)自花卉市場(chǎng)。

菌種質(zhì)粒：質(zhì)粒pCAMBIA3300、農(nóng)桿菌EHA105為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)藥品：限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自Promega公司，Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶購(gòu)自北京全式金生物工程公司，膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。200 bp ladder Marker購(gòu)自加拿大MBI公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗甲磺隆ALS基因的獲得 取1 000粒野生型結(jié)縷草種子種植于花盆中，待植株生長(zhǎng)至10 cm時(shí)噴灑1%甲磺隆溶液。取存活下來(lái)的植株，通過CTAB法提取植物總DNA。根據(jù)NCBI上已知的ALS基因序列設(shè)計(jì)引物Primer1、Primer2，通過PCR擴(kuò)增獲得ALS基因。模板用根據(jù)已發(fā)表的PR10a啟動(dòng)子序列（Genbank AB513331.1）設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增。引物序列為：

Primer1：5′-CTCGAGATGGCCACCACCCCGACAAC-3′

Primer2：5′-CTCGAGCACTGAAGATATAATCTAAC-3′

PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物連入TA克隆載體pEAZY-T1，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，并用DNAMAN和DNASIS軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用Xho I將pEAZY-ALS上的ALS基因切下，連接到用相同酶切的p3300大片段上，經(jīng)Xho I酶切驗(yàn)證正確后，命名為p33-ALS。

1.2.3 轉(zhuǎn)化和篩選 挑選500粒飽滿、無(wú)損傷的玉米種子，經(jīng)0.1%氯化汞浸泡消毒后，加入150 mL無(wú)菌水，室溫90 r/min振蕩12 h。將吸水膨脹種子進(jìn)行劃胚處理后，加入15 mL OD值為1的農(nóng)桿菌菌液，共培養(yǎng)48 h。將共培養(yǎng)后的種子播種在含有蛭石的營(yíng)養(yǎng)土中，當(dāng)玉米苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，用0.5%的甲磺隆溶液噴灑篩選。篩選存活的玉米植株，經(jīng)PCR檢測(cè)表現(xiàn)陽(yáng)性的植株移至大盆，繼續(xù)生長(zhǎng)直至結(jié)實(shí)。

1.3 PCR檢測(cè)

采用CTAB法提取6葉期除草劑抗性玉米的總DNA，以此為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)ALS基因是否插入玉米基因組中。ALS基因檢測(cè)用的引物序列如下：

Primer3：5′-GGAGTGACGTTGGGGCATC-3′

Primer4：5′-ACTCGTGTGACGGCAGGAC-3′

預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為526 bp。

PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（北京天根生物技術(shù)有限公司） 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 nmol/μL），DNA模板1 μL（100 ng/μL），ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；之后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸8 min。試驗(yàn)以未轉(zhuǎn)化植株的DNA為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立去離子水為模板的空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 除草劑抗性試驗(yàn)

將非轉(zhuǎn)基因玉米和經(jīng)過PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的玉米植株后代種植于土壤中，待長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，用0.5%、1.0%、2.5%、5.0%的甲磺隆溶液噴灑篩選分析除草劑抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 片段的克隆與序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，成功獲得了與目的基因大小相符的約為2 kbp的DNA片段（圖1A）。片段插入TA克隆載體pEAZY-T1后，命名為pEAZY-ALS。測(cè)序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增所獲得的ALS基因序列全長(zhǎng)1 938 bp，與報(bào)道序列（GenBank accession number AB513331.1）有34個(gè)堿基的差異，同源性為98.6%，所編碼的氨基酸有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了改變，經(jīng)與除草劑敏感型水稻、除草劑抗性水稻的ALS蛋白序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，其中第549位、628位改變與其抗性產(chǎn)生相關(guān)，而第55位氨基酸的差異僅為進(jìn)化中產(chǎn)生的隨機(jī)突變（圖1B）。與玉米ALS蛋白序列比較結(jié)果表明兩者之間有88.9%的同源性，而玉米內(nèi)源的ALS蛋白中第549位、第628位氨基酸與除草劑敏感型水稻一致，屬于除草劑敏感型。為進(jìn)一步進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提高玉米除草劑抗性提供了依據(jù)。

2.2 p33-ALS 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖2A所示，通過亞克隆將ALS基因替換p3300上的bar基因。用XhoⅠ酶切pEAZY-ALS和p3300，分別回收pEAZY-ALS酶切產(chǎn)物中的小片段和p3300酶切產(chǎn)物中的大片段，用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用XhoⅠ酶切鑒定釋放出長(zhǎng)約1.98 kbp的片段（圖2B），最終經(jīng)測(cè)序證實(shí)插入方向正確的重組載體命名為p33-ALS。

2.3 除草劑抗性植株的獲得及PCR檢測(cè)

從圖3A所示的植物株中經(jīng)過篩選共計(jì)獲得抗除草劑玉米植株7株（圖3B），經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)的結(jié)果如圖3C所示，獲得的7株抗性植株均為陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)化率為1.4%。

2.4 除草劑抗性試驗(yàn)

經(jīng)過不同的甲磺隆溶液噴灑1周后，0.5%甲磺隆溶液即可對(duì)野生型玉米植株產(chǎn)生影響，由圖4可知，野生型植株在用5%甲磺隆溶液噴灑后1周即完全死亡，而T1代PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株幾乎完全不受影響。

3 結(jié)論與討論

本研究分離得到的ALS基因?qū)胗衩谆蚪M后能夠極大地提高對(duì)甲磺隆的耐受能力。T1代的除草劑試驗(yàn)表明外援基因已整合到基因組中并能夠順利的遺傳到后代。對(duì)該基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，第549位W轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)、第628位S轉(zhuǎn)變?yōu)镮，與水稻ALS蛋白對(duì)甲磺隆抗性的突變結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)位點(diǎn)與甲磺隆抗性相關(guān)，為進(jìn)一步研究該基因功能提供佐證。

盡管利用植物組織培養(yǎng)等方法能夠獲得轉(zhuǎn)基因植株，但是往往由于長(zhǎng)時(shí)間的繼代、篩選等過程導(dǎo)致再生植株出現(xiàn)各種非遺傳方面的變異。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萌動(dòng)胚轉(zhuǎn)化法，集傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和不依賴于組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)于一身，是玉米轉(zhuǎn)基因方法中優(yōu)良的備選方案。因此，本試驗(yàn)選用了該方法作為創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)的手段。

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