鐘欣　劉明妍　姚維凡　杜可　楊時倫　趙海山　魏敏杰

中國醫(yī)科大學(xué)藥理教研室

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EGCG通過NGF/TrkA通路影響APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ沉積的研究

鐘欣劉明妍姚維凡杜可楊時倫趙海山魏敏杰

中國醫(yī)科大學(xué)藥理教研室

摘要:目的探討綠茶的有效多酚成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對淀粉樣前體蛋白/早老素基因(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積及其對海馬內(nèi)神經(jīng)生長因子(NGF)相關(guān)神經(jīng)生長因子受體(TrkA)信號通路的影響。方法采用免疫組化及Western blot法分別檢測小鼠海馬Aβ1-40、淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白表達(dá)水平，Western blot檢測小鼠海馬NGF及神經(jīng)生長因子前體(proNGF)的表達(dá)水平及其共同受體TrkA下游細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬內(nèi)Aβ1-40和APP表達(dá)(42.35±8.25、143.63±24.30)較對照組(13.04±4.36、19.89±4.93)均顯著增加(均P<0.05)，治療組(19.72±6.55、38.07±18.19)較模型組明顯降低(均P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組(均為100)比較，模型組小鼠海馬內(nèi)Aβ1-40、APP的相對表達(dá)量增加(分別為363.39±45.77、499.51±65.75，均P<0.01)，與模型組比較，治療組Aβ1-40、APP相對表達(dá)量顯著降低(分別為179.77±18.17、160.42±44.55，均P<0.01)。與對照組(均為100)比較，模型組NGF(16.39±4.03)、pro-NGF(25.92±5.37)、NGF/pro-NGF(63.64±10.68)、p-TrkA(7.92±2.13)、p-c-raf(7.37±2.66)、p-ERK1/2(13.53±4.44)及p-CREB(3.95±1.56)的相對表達(dá)量降低(均P<0.05)；與模型組比較，治療組NGF(80.78±12.18)、pro-NGF(48.63±3.83)、NGF/pro-NGF(165.84±19.02)、p-TrkA(72.33±6.21)、p-c-raf(88.12±5.33)、p-ERK1/2(60.21±10.34)及p-CREB(25.31±8.48)的相對表達(dá)量明顯增加(均P<0.05)。治療組與對照組上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論EGCG主要通過上調(diào)NGF/proNGF比例，增加NGF的相對表達(dá)，繼而激活其下游特異性TrkA通路，顯著增加TrkA、c-raf、ERK1/2及其下游效應(yīng)蛋白CREB的磷酸化水平，從而抑制Aβ1-40和APP的表達(dá)，改善學(xué)習(xí)記憶障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:表沒食子兒茶素沒食子酸酯；神經(jīng)生長因子；TrkA；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；β-淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞間出現(xiàn)大量以β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積為核心的老年斑(senile plaques，SP)及神經(jīng)元丟失等[1]。研究表明，淀粉樣前體蛋白(APP)在β-分泌酶的作用下水解產(chǎn)生大量Aβ沉積，Aβ的大量沉積通過氧化應(yīng)激、鈣超載、細(xì)胞調(diào)亡等方式啟動了神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性改變，進(jìn)而出現(xiàn)AD樣病變[2]。本文作者課題組前期的試驗結(jié)果已證實表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG〕可通過抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75信號通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善AD中的學(xué)習(xí)記憶障礙[3]，然而，與p75通路密切相關(guān)的神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)以及酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A，TrkA)通路在EGCG抑制Aβ沉積過程中所發(fā)揮的作用未明，因此，本研究擬進(jìn)一步以淀粉樣前體蛋白/早老素1(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，從EGCG改善NGF相關(guān)TrkA信號通路的角度，探討其改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及抑制其腦內(nèi)Aβ沉積的可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：9月齡C57 BL/6J小鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量(21±4)g；9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量(19±3)g。動物均由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗過程中動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.1.2主要試劑及儀器：Aβ1-40抗體及EGCG購自sigma公司，APP、TrkA、p-TrkA、c-raf、p-c-raf、ERK1/2、p-ERK1/2抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自CST公司，NGF、NGF前體(pro-NGF)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)、β-actin抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，RIPA Buffer裂解緩沖液、BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，PMSF購自Roche公司，Super ECL Plus超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)公司。

1.2方法實驗分三組進(jìn)行。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠分為EGCG處理APP/PS1組(治療組)和模型組兩組，每組10只，雌雄各半，治療組按體質(zhì)量2 mg/(kg·d)給予EGCG〔EGCG配制成0.04%(質(zhì)量濃度)的水溶液〕灌胃，模型組給予相同體積的雙蒸水灌胃，1次/d；對照組：為C57BL/6J小鼠10只，以等體積于治療組的雙蒸水灌胃，1次/d。三組均連續(xù)灌胃4周，4周給藥結(jié)束后，處死動物，取海馬組織，或組織固定。

1.2.1免疫組化法檢測小鼠腦組織中Aβ1-40和APP蛋白表達(dá)：行為學(xué)實驗結(jié)束24 h后，將各組小鼠各5只先以水合氯醛麻醉并以200 mL生理鹽水心室內(nèi)灌流，繼而更換4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液灌流，取腦固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片進(jìn)行免疫組化染色。切片進(jìn)行脫蠟、水化，3%(質(zhì)量濃度)H2O2于37℃孵育20 min，微波修復(fù)，正常山羊血清封閉液37℃封閉30 min，一抗抗體(Aβ1-40抗體和APP抗體)4℃孵育過夜，PBS洗后，二抗37℃孵育1 h，DAB顯色，每張切片隨機(jī)數(shù)海馬區(qū)3個視野，用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別測定各組小鼠每張切片內(nèi)陽性表達(dá)Aβ1-40和APP蛋白神經(jīng)元的整合光密度值，其整合光密度值的大小與Aβ1-40和APP的表達(dá)水平成正比。Aβ1-40和APP抗體標(biāo)記的棕色區(qū)域即為陽性表達(dá)Aβ1-40和APP蛋白的神經(jīng)元。使用圖像分析軟件對圖片中陽性染色區(qū)域的累積光密度進(jìn)行定量，再對單位面積的光密度值進(jìn)行平均得到的數(shù)值即稱為整合光密度值。

1.2.2小鼠海馬中相關(guān)蛋白表達(dá)檢測：以Western blot法檢測小鼠海馬中Aβ1-40、APP、NGF、pro-NGF、p-TrkA、p-c-Raf、p-ERK1/2、p-CREB等蛋白表達(dá)。取各組5只小鼠海馬組織，放入預(yù)冷的RIPA Buffer裂解緩沖液及0.1%PMSF混合物中，冰上勻漿后，4℃以12000 g離心30 min，取上清，BCA法蛋白定量。每孔蛋白上樣量50 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%(質(zhì)量濃度)BSA的PBST中室溫封閉2 h，分別加入NGF、pro-NGF、TrkA、p-TrkA、c-raf、p-c-raf、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB1、p-CREB、APP、Aβ1-40、β-actin等一抗于4℃過夜，次日TBST洗膜后，加入相應(yīng)的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，ECL顯影。按照蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)確定目的條帶位置并測定灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值為上述蛋白相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示。三組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用Turkey’s post hoc test法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組海馬內(nèi)Aβ1-40和APP蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，模型組海馬區(qū)Aβ1-40和APP陽性染色的棕色斑塊與對照組比較顯著增多，治療組的斑塊較模型組明顯減少(圖1)。模型組與對照組比較，Aβ1-40和APP陽性染色神經(jīng)元的整合光密度值明顯升高，治療組與模型組比較顯著下降(均P<0.05)。治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

Western blot結(jié)果(圖2、表1)亦顯示，模型組海馬內(nèi)Aβ1-40和APP的蛋白灰度值與對照組比較明顯增加，治療組海馬內(nèi)Aβ1-40和APP的蛋白灰度值與模型組比較顯著降低(均P<0.01)，治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組海馬內(nèi)NGF、pro-NGF、NGF/pro-NGF、p-TrkA、p-c-Raf、p-ERK1/2、p-CREB的相對表達(dá)比較 模型組海馬內(nèi)NGF和pro-NGF蛋白灰度值與對照組比較明顯降低，治療組海馬內(nèi)NGF和pro-NGF的蛋白灰度值與模型組比較增加(均P<0.05)(圖3、表2)；與對照組比較，模 型組NGF/pro-NGF比率降低(P<0.05)(表2)，治療組與模型組比較NGF/pro-NGF的比率明顯上調(diào)(P<0.01)；治療組與對照組比較上述指標(biāo)差異均無差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。 模型組小鼠海馬內(nèi)p-TrkA、p-c-Raf、p-ERK1/2、p-CREB相對灰度值與對照組比較明顯降低，治療組小鼠海馬內(nèi)的上述蛋白相對灰度值顯著高于模型組(均P<0.05)，治療組與對照組比較上述指標(biāo)差異均無差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4、表3)。

圖1各組小鼠腦組織海馬中Aβ1-40和APP表達(dá)比較(免疫組織化學(xué))染色

表 1　兩種方法檢測各組小鼠海馬內(nèi)Aβ1-40及APP表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖2各組小鼠海馬中Aβ1-40和APP蛋白表達(dá)比較(Western blot)

圖3各組小鼠海馬中NGF及pro-NGF表達(dá)比較(Western blot)

表 2　各組小鼠海馬內(nèi)NGF、pro-NGF、NGF/pro-NGF

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖4各組小鼠海馬中p-TrkA、c-Raf、p-ERK1/2、p-CREB的蛋白表達(dá)比較(Western blot)

表 3　各組小鼠海馬內(nèi)p-TrkA、p-c-Raf、p-ERK1/2、p-CREB相對表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3討論

NGF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有支持神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、分化、維持和生存等生物學(xué)效應(yīng)，NGF可通過與TrkA特異性結(jié)合，激活其下游信號通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活作用，同時TrkA信號通路的激活還可阻抑p75NTR信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。proNGF作為腦內(nèi)合成NGF的前體蛋白，在蛋白酶作用下被降解為NGF，其生物學(xué)效應(yīng)與NGF相反，即與p75NTR發(fā)生特異性結(jié)合，激活p75NTR信號通路，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞丟失和凋亡，并同時可抑制TrkA信號通路的激活，抑制細(xì)胞增殖和存活[4]。已有文獻(xiàn)報道AD腦組織中NGF水平降低是導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生退行性變的機(jī)制之一。當(dāng)腦內(nèi)NGF匱乏時，NGF/TrkA信號通路受到抑制，從而影響其下游信號通路的活化和與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退化及Aβ沉積、學(xué)習(xí)記憶障礙[5]。此外，Autio等[6]發(fā)現(xiàn)TrkA磷酸化水平?jīng)Q定了CREB的磷酸化水平。Matrone等[7]研究發(fā)現(xiàn)NGF可誘導(dǎo)APP磷酸化，并與TrkA相互作用，調(diào)節(jié)NGF/TrkA信號通路的激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和生存，這表明NGF本身也與APP及Aβ的沉積也密切相關(guān)。因此，開發(fā)能夠改善AD患者腦內(nèi)NGF低表達(dá)水平并可以激活TrkA及其下游信號通路的功能，進(jìn)而有效改善AD癥狀的新藥，并對其進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的探討，對于深入研究AD具有較大的意義。

EGCG是綠茶的一種主要多酚成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗癌等作用[8]。已有報道EGCG在體外對3-羥基犬尿氨酸(3-Hydroxykynurenine，3-HK)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，轉(zhuǎn)染瑞典型人類APP基因突變的嚙齒類神經(jīng)元樣N2a細(xì)胞，APP過表達(dá)TgAPPsw2576單轉(zhuǎn)基因小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞，以及對D-半乳糖誘導(dǎo)的AD小鼠、TgAPPswline 2576單轉(zhuǎn)基因小鼠、PS2單轉(zhuǎn)基因小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠海馬內(nèi)APP和Aβ1-40蛋白表達(dá)水平與模型組比較明顯下降，另外，模型組與對照組比較NGF及proNGF的蛋白表達(dá)水平皆下降，但proNGF相對表達(dá)降低程度不及NGF降低明顯(即NGF/pro-NGF比值增高)，表明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的NGF功能應(yīng)以proNGF介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)為主，提示EGCG可能通過增加NGF相對表達(dá)，激活其下游功能性受體TrkA進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而且，治療組小鼠腦內(nèi)p-TrkA及其下游p-c-Raf、p-ERK1/2和p-CREB等蛋白的表達(dá)水平顯著高于模型組，并且EGCG使p-CREB表達(dá)水平的增加與抑制Aβ1-40和APP的沉積及改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙也存在密切關(guān)系。有研究證實，CREB蛋白的磷酸化和激活，也可阻斷Aβ的寡聚化和形成，降低APP加工過程中的γ-分泌酶的mRNA及蛋白表達(dá)，從而減少Aβ形成，緩解APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的長時程增強(qiáng)缺陷，增加突觸可塑性[9]。

綜上所述，EGCG可能主要通過上調(diào)NGF的相對表達(dá)水平，激活NGF-TrkA通路及其下游ERK通路，從而在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中降低Aβ沉積，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Effects on Aβ depositionin in brains ofAPP/PS1 transgenic mice by EGCG through NGF/Trk Asignaling pathway

ZHONGXin，LIUMingyan，YAOWeifan，DUKe，YANGShilun，ZHAOHaishan，WEIMinjie*.

*DepartmentofPharmacology,CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,ShenyangLiaoning110001,China

ABSTRACT:ObjectiveTo discuss the effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG) in green tea on Aβ deposition in brains of Amyloid precursor protein / presenilin-1 gene(APP/PS1) transgenic mice and the related nerve growth factor(NGF)/tyrosine kinase A(TrkA) signaling pathway in the hippocampus. MethodsImmunohistochemistry and Western blot methods were used to detect the levels of Aβ1-40 and APP in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice. The expressions of NGF and pro-NGF in the hippocampus were detected by Western blot, as well as the expression levels of its receptor TrkA and the downstream of the extracellular signal-regulated kinase(ERK) pathway. ResultsImmunohistochemical detection showed that the expressions of Aβ1-40 and APP of the model group(42.35±8.25，143.63±24.30) increased compared with the control group(13.04±4.36，19.89±4.93, P<0.05, respectively)， while the expression levels of the treatment group(19.72±6.55，38.07±18.19) were far lower than the model group(P<0.05, respectively). Western blot results showed that compared with the control group(100, respectively), the relative expressions of Aβ1-40 and APP of the model group increased(363.39±45.77，499.51±65.75， P<0.01, respectively) and NGF(16.39±4.03), pro-NGF(25.92±5.37), NGF/pro-NGF(63.64±10.68), p-TrkA(7.92±2.13), p-c-raf(7.37±2.66), p-ERK1/2(13.53±4.44) and p-CREB(3.95±1.56) decreased(P<0.05, respectively). The relative expression levels of Aβ1-40 and APP of the treatment group179.77±18.17，160.42±44.55， P<0.01, respectively) were much lower than the model group, while the relative expression levels of NGF(80.78±12.18), pro-NGF(48.63±3.83), NGF/pro-NGF(165.84±19.02), p-TrkA(72.33±6.21), p-c-raf(88.12±5.33), p-ERK1/2(60.21±10.34) and p-CREB(25.31±8.48) of the treatment group were significantly higher than the model group(P<0.05, respectively). There were no significant differences between the treatment group and the control group(P>0.05, respectively). ConclusionsEGCG could reduce Aβ1-40 and APP expression levels in brains of the APP/PS1 transgenic mice by enhancing the relative expression level of NGF as well as increasing the NGF/proNGF ratio in the APP/PS1 mice. Moreover, after EGCG treatment, TrkA signaling was activated by significantly increasing the phosphorylation of TrkA c-Raf, ERK1/2 and downstream effector CREB, thereby the Aβ1-40 and APP expressions are inhibited, learning and memory disorders are improved, and EGCG finally plays a neuroprotective effect.

Key words:(-)-epigallocatechin-3-gallate； nerve growth factor；TrkA；APP/PS1 transgenic mouse；β-amyloid protein

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.02.006

基金項目：國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項子課題(2013ZX09103001-003)；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L2012279)；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃項目(2013225079)

通訊作者：魏敏杰，Email：mjwei@mail.cmu.edu.cn

中圖分類號：R741.02

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)02-0104-05

Corresponding author:WEI Minjie, Email：mjwei@mail.cmu.edu.cn

(收稿日期：2014-06-30)