趙波　何家候　朱俊玲　王舉磊　李柱一　王文挺

710038第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科(朱俊玲、王舉磊)；730070蘭州軍區(qū)蘭州總院安寧分院神經(jīng)內(nèi)科(趙波)；710038第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(趙波、李柱一)；710032第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅(何家候)；710032第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室暨腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心(王文挺)

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轉(zhuǎn)基因小鼠熒光神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)聯(lián)的建立
——膜片鉗記錄結(jié)合激光共聚焦三維重建

趙波何家候朱俊玲王舉磊李柱一王文挺

710038第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科(朱俊玲、王舉磊)；730070蘭州軍區(qū)蘭州總院安寧分院神經(jīng)內(nèi)科(趙波)；710038第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(趙波、李柱一)；710032第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅(何家候)；710032第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室暨腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心(王文挺)

摘要:目的在細胞水平建立神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)。方法利用D1多巴胺受體表達紅色熒光蛋白的細菌人工染色體(bacterial artifical chromosome，BAC)轉(zhuǎn)基因小鼠制備腦片，對D1多巴胺受體熒光陽性紋狀體中等多棘神經(jīng)元(medial spiny neurons, MSNs)進行膜片鉗電生理記錄和細胞標記，再經(jīng)激光共聚焦系統(tǒng)對該神經(jīng)元進行結(jié)構(gòu)的三維重建，觀察MSN樹突分支密度以及樹突棘形態(tài)學(xué)特點。結(jié)果(1)電生理結(jié)果提示所標記的細胞具有偏超級化的靜息膜電位(-87 mV)、較小的輸入電阻(16.4 MΩ)及較長的動作電位潛伏期(172 ms)等典型的MSN電生理學(xué)特征。(2)三維重建結(jié)果可見細胞胞體略成圓錐體，樹突呈放射狀向四周發(fā)散。(3)進行樹突棘重塑后發(fā)現(xiàn)MSNs平均樹突棘長度(2.37±0.14)μm，平均寬度為(1.39±0.14)μm。結(jié)論描述神經(jīng)元功能的膜片鉗數(shù)據(jù)與三維重建的細胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法可建立神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞:神經(jīng)元；細菌人工染色體轉(zhuǎn)基因技術(shù)；膜片鉗；細胞標記；三維重建

神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能密不可分，其結(jié)構(gòu)變化必然導(dǎo)致功能改變。因此同步記錄神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變具有重要的研究意義。神經(jīng)元分為多種不同類型，如紋狀體的投射神經(jīng)元為中等多棘神經(jīng)元(medial spiny neurons, MSNs)，根據(jù)表達的多巴胺受體的不同，可以將其分為表達多巴胺受體1的MSNs(D1 MSNs)和表達多巴胺受體2的MSNs(D2 MSNs)[1]。兩種MSNs分別組成了基底節(jié)直接通路及間接通路，參與紋狀體及整個基底神經(jīng)節(jié)的功能調(diào)節(jié)。但在以往研究中，由于無法準確區(qū)分上述兩類神經(jīng)元，因而無法對直接及間接通路的功能進行精確研究?，F(xiàn)有研究表明，利用細菌人工染色體(bacterial artifical chromosome，BAC)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將熒光蛋白標記到特定類型神經(jīng)元[2]，從而實現(xiàn)研究特定類型神經(jīng)元的目的。本實驗中，通過利用使D1 MSNs表達紅色熒光蛋白的BAC轉(zhuǎn)基因小鼠制作紋狀體腦片[3]，通過熒光顯微鏡，準確選擇這些紅色熒光陽性的MSNs，并利用膜片鉗技術(shù)進行電生理記錄及細胞標記，從而可以同時獲得特定神經(jīng)元的電生理學(xué)和形態(tài)特征。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：選取1.5～2個月齡健康D1-Td Tomato轉(zhuǎn)基因小鼠，雌雄不限。該小鼠由麻省理工學(xué)院McGovern腦研究所馮國平教授贈送[3]，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。實驗動物飼養(yǎng)符合國家醫(yī)學(xué)實驗動物管理標準，所有實驗獲第四軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，并遵循實驗動物保護、倫理規(guī)范。

1.1.2主要試劑及儀器：切片液配方(mmol/L)：氯化膽堿115，氯化鉀2.5，磷酸二氫鈉1.25，氯化鈣0.5，氯化鎂8，碳酸氫鈉26，葡萄糖10，抗壞血酸0.1，丙酮酸鈉0.4，滲透壓 300～305 mOsm。人工腦脊液(artificial cerebral spinal fluid，ACSF)配方(mmol/L)：氯化鈉119，氯化鉀2.3，磷酸二氫鈉1.0，氯化鈣2.5，氯化鎂1.3，碳酸氫鈉26，葡萄糖11，滲透壓 300～305 mOsm。電極內(nèi)液配方(mmol/L)：葡萄糖酸鉀128，羥乙基哌嗪乙磺酸10，磷酸肌酸鈉 10，乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸 1.1，三磷酸腺苷鎂鹽5，三磷酸鳥苷鈉鹽0.4，0.5%(質(zhì)量分數(shù))neurobiotin (藍色熒光)350，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至7.4，用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至300～305 mOsm。以上藥品均購自Sigma公司。Streptavidin, Alexa Fluor?350 conjugate(S11249，Molecular probe, USA)。振動切片機(Vibratome 1000 plus)。水平程控電極拉制儀(P-97, Sutter Instruments, USA)。激光共聚焦顯微鏡(FV1000)及紅外微分干涉相差顯微鏡(Olympus，Japan)。膜片鉗放大器(axon 200A amplifier，Molecular Devices, USA)。電動顯微三維操控器(MX7600R，SD，USA)。

1.2方法

1.2.1腦片制備：以1%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉按體質(zhì)量(30～40)mg/kg麻醉小鼠，麻醉成功后沿兩側(cè)剪開胸腔，暴露心臟，用20～30 mL 95% O2/5% CO2(均為體積分數(shù))混合氣飽和冰浴的切片液進行心臟灌流。之后迅速斷頭取腦，放入冰凍切片液中1～2 min。取出腦組織，俯臥位放置在切片液濕潤的濾紙上，切除大腦尾端后1/4。將腦組織以切面為底直立，用502膠粘接在切片臺上，腦組織背側(cè)對準刀片的方向。在95% O2/5% CO2(均為體積分數(shù))混合氣飽和的冰凍切片液中用振動切片機切取300～350 μm的含紋狀體的冠狀腦片。將腦片移至孵育槽中用32℃切片液孵育20 min后更換為室溫的ACSF，繼續(xù)孵育至少1 h后開始進行電生理記錄，記錄期間持續(xù)給予95% O2/5% CO2(均為體積分數(shù))混合氣。

1.2.2電生理記錄及細胞標記：選取典型的紋狀體腦片，放入記錄槽中。記錄槽以2～3 mL/min的流速給予ACSF灌流，利用記錄槽溫控裝置使記錄溫度維持在24～28℃。紅外微分干涉相差可視條件(DIC)下在40倍物鏡下選擇形狀呈卵圓形，直徑約10 μm，胞體圓潤，表面清晰、柔和，未見細胞核的細胞。本實驗所用轉(zhuǎn)基因小鼠系將紅色熒光蛋白(Td Tomato)特異性標記到D1 MSNs上，因此D1 MSNs在紅色熒光通道下發(fā)出紅色熒光，其余神經(jīng)元無熒光。確認紅色熒光陽性細胞進行全細胞膜片鉗記錄。記錄電極電阻3～5 MΩ。電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液電生理數(shù)據(jù)經(jīng)膜片鉗放大器放大，用Digidata 1322A數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Clampex 9.0 軟件采集、存儲和分析，數(shù)據(jù)采樣率為20 kHz，低頻濾波為5 kHz。

在高阻封接形成后,給電極以短暫的脈沖負壓吸破細胞膜后可見電容電流，代表細胞形成全細胞模式[4]，即開始計時，進行電生理刺激和記錄。在電流鉗模式下，給予從超極化到去極化的方波電流刺激，記錄其靜息膜電位及動作電位以進一步明確細胞類型。隨后留置電極10～15 min以使neurobiotin 350充灌到細胞遠端末梢。充灌完全后在藍色熒光通道下可見灌注到細胞內(nèi)的neurobiotin 350發(fā)出藍色熒光。完成記錄后以最小檔速度控制電動顯微三維操控器緩慢將電極從細胞表面退出。腦片在記錄槽中用10 mL/min流速沖洗30 min后放置到4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中固定過夜。次日將固定好的腦片用1×PBS低速振蕩清洗3次，每次10 min。5%(質(zhì)量濃度)BSA+0.3%(體積分數(shù))triton室溫下封閉1 h。加入streptavidin, Alexa Fluor?350 conjugate(用上述3%BSA+0.3%triton稀釋至1∶600)4℃孵育過夜。第3天以1×PBS低速振蕩清洗3次，每次10 min。使記錄細胞層面向上放置在載玻片上，50%(體積分數(shù))甘油封片。

A：低倍鏡下的紋狀體記錄區(qū)域(虛線上部分為皮層部分，之下部分為紋狀體部分；物鏡×4)； B：IR-DIC模式下典型的MSN神經(jīng)元(物鏡×40)；C：紅色熒光通道下的圖像(物鏡×40)；D：藍色熒光通道下的圖像(物鏡×40)；E：IR-DIC、紅色通道和藍色通道的融合圖像

圖1選擇熒光標記的D1受體陽性MSNs進行電生理記錄和細胞標記

用激光共聚焦顯微鏡觀察腦片，10倍物鏡下確認記錄的部位，尋找藍色熒光細胞。如藍色熒光在位置上與紅色熒光重合代表標記成功。根據(jù)藍色細胞細胞突起的范圍選擇20倍或40倍物鏡，確認包含所標記細胞突起的Z軸最高和最低層面，每層厚度為1～1.5 μm，選擇XYZ模式對整個細胞進行逐層掃描。分析樹突棘時選擇樹突中段(距胞體100 μm)的一段樹突(長約50 μm)進行三維重建。切換到60倍油鏡，確認Z軸樹突最高層面和最低層面，以層厚1～1.5 μm、XYZ模式對選擇的樹突進行掃描。實驗完畢后存儲為默認格式。

1.2.3標記細胞三維重建和分析：圖像文件在Imaris 7.8中打開，選擇藍色通道，將顯示顏色切換到綠色。添加新的Filaments，選用自動模式對細胞整個突起進行三維重建。利用重建后的結(jié)果對整個樹突的復(fù)雜度進行sholl分析，結(jié)果導(dǎo)入到Prism 6.0(GraphPad Software, Inc., USA)進行作圖和分析。隨后添加新的Filaments，選擇分析樹突棘，采用自動模式辨別樹突棘。所得樹突棘數(shù)目、長度、寬度等數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Prism 6.0進行作圖和分析，觀察距胞體不同距離上樹突分布以及樹突棘數(shù)目、長度、寬度等特點。

2結(jié)果

2.1紋狀體MSNs細胞標記及電生理結(jié)果 在紋狀體記錄區(qū)域(圖1A)，40倍物鏡、IR-DIC模式下可見散在的MSNs(圖1B，圖中虛線區(qū)域所示，下同)。D1 MSNs在紅色熒光通道下呈現(xiàn)紅色熒光(圖1C)。形成全細胞模式后，切換到藍色熒光通道時可見胞體充盈藍色熒光(圖1D)。不同通道的圖片經(jīng)存儲和后期處理可見所記錄的細胞在紅外微分干涉相差可視條件、紅色通道和藍色通道重合(圖1E)，在形態(tài)學(xué)上證明所標記的細胞即為Td Tomato所標記的D1 MSNs。在給予方波刺激后細胞靜息膜電位為-87 mV，在超極化狀態(tài)下輸入電阻為16.4 MΩ，在去極化刺激達到閾值時動作電位潛伏期為172 ms(圖2)。

圖2電流鉗模式下神經(jīng)元動作電位模式圖：在電流鉗模式下，神經(jīng)元靜息膜電位為-87 mv(A)；給予強度不斷增大的方波刺激(電流強度-0.2 mA～0.38 mA)后可誘發(fā)出動作電位(B)，動作電位潛伏期172 ms，輸入電阻16.4 MΩ，基強度0.24 pA

2.2紋狀體MSNs細胞三維重建及樹突分布分析 三維重建后可見所標記細胞胞體略呈圓錐形，樹突呈放射狀向四周發(fā)散(圖3A)；對細胞進行突起追蹤，平面圖(圖3B)可見細胞的突起向四周分散。sholl分析結(jié)果提示該細胞樹突走行在距胞體100 μm的距離具有最多的分支，隨著距離胞體距離增加樹突分支逐漸減少，據(jù)胞體較近區(qū)域分支也較少(圖4)。

A：經(jīng)Imaris軟件重建熒光標記神經(jīng)元的3D圖像；B：對圖A細胞進行突起追蹤所得平面圖

圖3膜片鉗記錄和標記后的整個神經(jīng)元的三維重建分析圖

圖4經(jīng)sholl分析所得熒光標記神經(jīng)元的樹突分支的分布曲線圖

A：樹突的三維重建圖像；B：對A圖追蹤和重塑所得樹突棘3D圖像

圖5 對距胞體100 μm的一段神經(jīng)元樹突經(jīng)膜片鉗記錄和標記后的三維重建分析圖

2.3標記細胞三維紋狀體MSNs樹突棘形態(tài)學(xué)特點 選取距胞體100 μm的一段樹突進行三維重建，可見大量樹突棘圍繞樹突段分布(圖5A)，在此基礎(chǔ)上對樹突棘進行標記和重塑(圖5B)。所標記的樹突棘計數(shù)為32個，平均突觸棘長度(2.37±0.14)μm，平均寬度(1.39±0.14)μm。

3討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括多種類型神經(jīng)元，如紋狀體神經(jīng)元除MSNs外還包括高頻放電中間神經(jīng)元、低閾值中間神經(jīng)元和膽堿能中間神經(jīng)元[5]。這些中間神經(jīng)元和MSNs相互作用，形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，參與了紋狀體及整個基底神經(jīng)節(jié)的功能調(diào)節(jié)。因此研究者常常面臨如何精確選擇神經(jīng)元的問題。本實驗中，作者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將熒光蛋白與特定受體相結(jié)合，使表達特定受體的神經(jīng)元發(fā)出特定顏色熒光，起到精確選擇神經(jīng)元類型的目的。

本研究中作者聯(lián)合應(yīng)用BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)、全細胞膜片鉗技術(shù)、免疫熒光技術(shù)以及圖像三維重建和分析技術(shù)，對D1 MSNs分別進行了電生理學(xué)記錄、細胞標記以及突觸形態(tài)特點的研究。結(jié)果表明，實驗中標記成功的細胞具有：(1)偏超級化的靜息膜電位；(2)膜電位超極化時較小的輸入電阻；(3)較長的動作電位潛伏期。以上特點完全符合MSN典型電生理學(xué)特點[5]，表明本研究中所用方法可以在精確選擇神經(jīng)元類型的同時獲得特定神經(jīng)元電生理學(xué)指標以及形態(tài)學(xué)特性，從而有助于對神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能進行同步研究。

神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能是相互作用，相互影響的。例如樹突的形態(tài)對傳入的突觸后神經(jīng)元信息傳遞有很大的影響[6]。樹突棘的減少可以在電生理上表現(xiàn)為微小突觸后電流頻率和幅度的降低[7]，并與多種精神疾病明顯相關(guān)[8]。因此，同時獲得神經(jīng)元的電生理學(xué)數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)特征有助于了解神經(jīng)元在整個神經(jīng)環(huán)路中的作用，對認識疾病的病理機制具有重要的參考價值。以往研究者經(jīng)常先記錄電生理學(xué)特性，隨后再通過免疫組化方法研究神經(jīng)元形態(tài)，不僅耗費時間較長，而且無法將單個神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)與電生理學(xué)數(shù)據(jù)準確聯(lián)系起來，因此獲得的結(jié)果有較大的局限性。本實驗中所用方法不僅可以同時研究確定類型的單個的神經(jīng)元功能與結(jié)構(gòu)，而且簡便易行，節(jié)省時間，因此較以往方法有明顯的進步。

此外，進一步利用圖像三維重建和分析技術(shù)，可以對某類神經(jīng)元在所在神經(jīng)環(huán)路中的突觸傳遞特征、樹突形態(tài)對突觸傳遞的影響，以及在疾病情況下上述指標的變化情況進行研究，使實驗中獲得的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)信息更多、更立體[9]，為探尋不同類型神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能相互關(guān)系提供豐富資料。

綜上可見，通過基因修飾技術(shù)選擇標記特定類型細胞，進而對這種類型細胞進行電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)記錄與分析，將會為特定類型神經(jīng)元的生理和病理功能提供更為深入的認識。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Association establishment between structure and function of fluorescent positive neurons in BAC mice——patch clamp combining confocal 3D imaging reconstruction

ZHAOBo,HEJiahou,ZHUJunling,WANGJulei,LIZhuyi,WANGWenting*.

*DepartmentofNeurobiologyandCollaborativeInnovationCenterforBrainScience,SchoolofBasicMedicine,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi710032,China

ABSTRACT:ObjectiveTo build the relevance between structure and function of neurons at the cellular level. MethodsThe striatum slices were made with D1 Td Tomato bacterial artifical chromosome(BAC) transgenic mice.The D1 Td Tomato positive medial spiny neurons (MSN) were recorded by patch clamping and filled with neurobiotin during patch. Then the 3D image of the dendritic tree and spine were observed by confocal microscopy and Imaris software. Results(1) The electrophysiological data of the marked cell showed hyperpolarized resting membrane potential(-87 mV),lower input resistance(16.4 MΩ) and longer action potential latency(172 ms).(2) The 3Dreconstruction image also showed classical structure of MSNs. The cell body had cone shape and the dendritic spine tree radiated to spread around. (3) The further analysis also provided the average length of dendrites was(2.37±0.14)μm.The average width of dendritic spine was (1.39±0.14)μm.ConclusionsThis method can offer a way to study the function and morphology of specific neuron type and help us to understand the role of these neurons in physiological and pathophysiological conditions.

Key words:neuron; bacterial artifical chromosome transgenic technology; patch clamp; cell marker; 3D reconstruction

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.02.005

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目資助(81371498， 81471342)

通訊作者：王文挺，Email，wwt0657@fmmu.edu.cn

中圖分類號：Q421

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)02-0100-05

Corresponding author:WANG Wenting,Email:wwt657@fmmu.edu.cn

(收稿日期：2015-08-31)