李中燕，鄧　俊，熊　彬，熊　瑛，王宋平△

(1.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科　635000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州 646000)

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麻黃堿對TNF-α誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞eotaxin表達(dá)的影響*

李中燕1，鄧俊2，熊彬2，熊瑛2，王宋平2△

(1.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科635000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的觀察麻黃堿對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)表達(dá)的影響，探討中藥麻黃治療哮喘的機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、TNF-α刺激組(TNF-α 20 ng/mL)、TNF-α+麻黃堿組(TNF-α 20 ng/mL+麻黃堿300 μg/mL)，每組細(xì)胞均設(shè)3個復(fù)孔培養(yǎng)18 h；熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞eotaxin mRNA的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和Western blot檢測各組細(xì)胞eotaxin蛋白的表達(dá)；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中eotaxin的濃度。結(jié)果與對照組比較，TNF-α刺激組上皮細(xì)胞eotaxin mRNA及蛋白表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中eotaxin的濃度明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與TNF-α刺激組比較，TNF-α+麻黃堿組以上各項指標(biāo)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論麻黃堿能抑制前炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的16HBE中eotaxin的表達(dá)及分泌，這可能是中藥麻黃治療哮喘的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]麻黃堿；哮喘；支氣管上皮細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

中藥麻黃是中醫(yī)用于治療咳喘病之要藥，近年來人們對麻黃所含成分、藥理作用進(jìn)行了深入研究，其中麻黃堿是其平喘的主要成分，但其平喘機(jī)制尚未完全闡明[1-2]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種前炎癥因子，可刺激氣道上皮細(xì)胞合成和釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，在哮喘的氣道炎性反應(yīng)和氣道重塑中起著重要作用[3-4]。本研究以體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)為研究對象，加入含TNF-α的培養(yǎng)基，模擬哮喘氣道炎性反應(yīng)條件，觀察一定濃度的麻黃堿對TNF-α致敏的16HBE表達(dá)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)的影響，探討麻黃治療哮喘的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料正常人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)株購于上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑胎牛血清購于杭州四季青生物工程公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，TNF-α購于美國派普泰克公司，β-actin一抗購于美國Santa Cruz公司，10%山羊血清封閉液、熒光二抗(FITC標(biāo)記羊抗兔IgG)購于北京中杉金橋生物公司，eotaxin 抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司，DAPI染色液、抗熒光淬滅封片液購于碧云天生物技術(shù)研究所，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司，eotaxin引物購于上海生工生物工程有限公司，eotaxin ELISA試劑盒購于蘇州卡爾文有限公司，TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購于大連寶生物工程有限公司，麻黃堿由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房提供。細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；低溫離心機(jī)：美國Sigma公司；酶聯(lián)免疫檢測儀：美國BIO-RAD公司；倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司；實時定量PCR 儀：美國Applied Biosystem 公司；熒光顯微鏡：德國Leica公司；ABI StepOne Plus Real-time PCR System：美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將16HBE以1×106個/mL接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清DMEM高糖完全培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿80%時，以1×105個/mL接種于6孔板培養(yǎng)，每孔體積2 mL，當(dāng)細(xì)胞長滿70%左右時，隨機(jī)分為3組。(1)對照組：無血清DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h；(2)TNF-α刺激組：無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/mL)培養(yǎng)18 h[5-6]；(3)TNF-α+麻黃堿組：無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中加入TNF-α(20 ng/mL)和麻黃堿(300 μg/mL)培養(yǎng)18 h[7]，每組均設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后收集培養(yǎng)上清液及細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2熒光定量PCR測定各組細(xì)胞eotaxin mRNA的表達(dá)(1)提取細(xì)胞總RNA：收集各組細(xì)胞按Trizol說明書提取總RNA，測量每組RNA的濃度、純度后，用RNase-free ddH2O將所有標(biāo)本RNA濃度調(diào)至40 ng/mL；(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：各組取10 μL RNA，按照說明書各自配成20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混勻，25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，將反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存；(3)實時熒光定量PCR：取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2.0 μL為模板，以GAPDH(產(chǎn)物263 bp)為內(nèi)參，eotaxin對應(yīng)的PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。eotaxin上游引物：5′-CCA ACC ACC TGC TGC TTT AAC CTG-3′，下游引物5′-GCT TTG GAG TTG GAG ATT TTT GG-3′，產(chǎn)物長度為205 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s 1個循環(huán)，95 ℃ 5 s，58 ℃ 34 s 40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s 1個循環(huán)。結(jié)果以2-△△CT作為被測因子mRNA的相對表達(dá)量(RQ值)。

1.3.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察各組細(xì)胞eotaxin蛋白的表達(dá)(1)將16HBE細(xì)胞制成濃度為1×103個/mL的細(xì)胞懸液，每孔50 μL接種于有蓋玻片的6孔板中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿載玻片70%左右時，如前所述方法將細(xì)胞隨機(jī)分為3組并更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h；(2)取出細(xì)胞爬片按照說明書進(jìn)行漂洗、4%多聚甲醛室溫固定20 min，10%山羊血清封閉液室溫封閉15 min，加入一抗(eotaxin 1∶100稀釋)100 μL 4 ℃過夜(用PBS液代替一抗作陰性對照)；加入FITC熒光標(biāo)記的二抗(1∶1 00稀釋)100 μL 37 ℃避光孵育1 h，染色封片后熒光顯微鏡攝像。

1.3.4Western blot檢測各組細(xì)胞eotaxin蛋白的表達(dá)裂解液RIPA裂解16HBE細(xì)胞，離心后用蛋白濃度微量檢測儀檢測裂解液總蛋白濃度，在總蛋白液中加入5×SDS凝膠上樣緩沖液40 μL，沸水煮6～10 min，-80 ℃保存。裂解液樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%牛血清清蛋白封閉、一抗孵育、洗膜、HRP標(biāo)記的二抗孵育等過程后，加入化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，成像保存。每組設(shè)置3個復(fù)孔，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光、顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)對所得條帶吸光度半定量，計算待測條帶的吸光度與內(nèi)參照吸光度比值，得出相對表達(dá)量。

1.3.5ELISA測定各組細(xì)胞上清液中eotaxin的含量按照ELISA試劑盒說明書操作測定各組細(xì)胞上清液中eotaxin蛋白的含量，于酶標(biāo)儀450 nm波長測定各孔樣品的吸光度(OD)值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣品中eotaxin的濃度。

2結(jié)果

2.1各組16HBE的eotaxin mRNA表達(dá)熒光定量PCR顯示內(nèi)參GADPH和目的基因eotaxin 融解曲線均為單峰曲線(圖1、2)，曲線峰值分別在86.62 ℃、83.19 ℃，融解溫度均一，峰的形狀較為尖銳，表明無非特異性產(chǎn)物及引物二聚體生成，引物特異性良好，退火溫度適中。與對照組細(xì)胞的eotaxin mRNA相對表達(dá)量(0.99±0.01)比較，TNF-α刺激組(3.03±0.32)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而TNF-α+麻黃堿組eotaxin mRNA相對表達(dá)量(1.82±0.23)明顯低于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1　GAPDH融解曲線

圖2　eotaxin融解曲線

A:對照組;B:TNF-α刺激組;C:TNF-α+麻黃堿組;D:陰性對照組。

圖3熒光顯微鏡觀察各組16HBE的eotaxin蛋白表達(dá)(×200)

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各組16HBE的eotaxin蛋白表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后熒光顯微鏡下觀察eotaxin綠色熒光主要表達(dá)在16HBE的胞質(zhì)中，對照組細(xì)胞eotaxin綠色熒光呈現(xiàn)弱表達(dá)，TNF-α刺激組表達(dá)明顯增強(qiáng)，TNF-α+麻黃堿組eotaxin綠色熒光表達(dá)較TNF-α刺激組明顯減弱，而陰性對照組細(xì)胞染色為陰性(圖3)。

2.3Western blot檢測各組16HBE的eotaxin蛋白表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果見圖4，與對照組細(xì)胞的eotaxin蛋白的相對表達(dá)量(1.27±0.25)比較，TNF-α刺激組eotaxin蛋白的相對表達(dá)量(3.87±0.60)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而TNF-α+麻黃堿組(2.77±0.35)明顯低于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:對照組；B:TNF-α組；C：TNF-α+麻黃堿組。

圖4Western blot檢測各組16HBE的eotaxin蛋白表達(dá)

2.4各組16HBE培養(yǎng)上清液中eotaxin的濃度與對照組上清液中eotaxin的濃度(1.72±0.16)pg/mL比較，TNF-α刺激組eotaxin的濃度(4.05±0.20)pg/mL明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而TNF-α+麻黃堿組eotaxin的濃度(3.70±0.21)pg/mL明顯低于TNF-α刺激組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥[8]。近年來的研究表明，氣道上皮細(xì)胞在哮喘發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，氣道上皮損傷與氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑密切相關(guān)，當(dāng)氣道受到環(huán)境激發(fā)因子刺激時，氣道上皮細(xì)胞首先受累，可合成和釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子[9-10]。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎性反應(yīng)中的主要炎癥細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)可引起支氣管平滑肌收縮，微血管滲漏和黏液分泌增加[5]。eotaxin在嗜酸性粒細(xì)胞的募集和脫顆粒過程中發(fā)揮重要作用，在哮喘發(fā)病過程中，eotaxin可趨化嗜酸性粒細(xì)胞從血液募集到氣道上皮并活化、釋放各種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致氣道上皮損傷[11]。而氣道上皮細(xì)胞在受到各種抗原和致炎因子刺激后釋放eotaxin，促進(jìn)氣道炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本實驗TNF-α刺激組氣道上皮細(xì)胞表達(dá)和釋放的eotaxin明顯高于對照組，表明TNF-α作為一種促炎因子，可刺激體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)并分泌eotaxin。

中藥麻黃具有發(fā)汗解表、宣肺平喘之功效，是中醫(yī)常用于治療咳喘病之要藥[12]。其主要成分麻黃堿可直接興奮支氣管平滑肌細(xì)胞的β受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，升高細(xì)胞內(nèi)和血漿環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，舒張支氣管平滑肌[13]。近年來的研究表明，含麻黃的中藥湯劑具有抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用[14-15]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)麻黃水提物霧化吸入能減輕哮喘小鼠氣道炎癥，抑制支氣管肺組織中IL-13、eotaxin的表達(dá)[16]。為了進(jìn)一步闡明麻黃治療哮喘的機(jī)制，本實驗從細(xì)胞水平進(jìn)一步觀察麻黃堿對促炎因子TNF-α致敏的16HBE表達(dá)eotaxin的影響，結(jié)果顯示TNF-α+麻黃堿組氣道上皮細(xì)胞eotaxin蛋白表達(dá)較TNF-α刺激組弱，eotaxin mRNA相對表達(dá)量明顯低于TNF-α刺激組，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中eotaxin的濃度亦明顯低于TNF-α刺激組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。本研究結(jié)果表明，麻黃堿能抑制前炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的16HBE中eotaxin的表達(dá)及分泌，這些研究結(jié)果為臨床上使用中藥麻黃治療哮喘提供了新的理論依據(jù)。

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Effect of ephedrine on expression of eotaxin in human bronchial epithelial cells stimulated by tumor necrosis factor-α*

Li Zhongyan1,Deng Jun2,Xiong Bin2,Xiong Ying2,Wang Songping2△

(1.Department of Respiratory Medicine,Dazhou Municipal Central Hospital,Dazhou,Sichuan 635000,China;2.First Department of Respiratory Medicine,Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou,Sichuan 646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of ephedrine on the expression of eotaxin in human bronchial epithelial cells (16HBE) stimulated by tumor necrosis factor-α(TNF-α) and to explore the mechanism of Chinese medicine ephedra in treating asthma.MethodsThe in vitro cultured 16HBE were randomly divided into the control group,TNF-α stimulation group(TNF-α 20 ng/mL) and TNF-α plus ephedrine group (TNF-α 20 ng/mL plus ephedrine 300 μg/mL).Three complex holes in each group were set to culture for 18 h,the eotaxin mRNA expression was measured by real time fluorescent quantified PCR and protein level was detected by immunocytochemical stain and Western blot.The eotaxin concentration in cells culture supernatant was quantified by ELISA.ResultsCompared with the the control group,the expression level of eotaxin mRNA and protein,and the concentration of eotaxin in cell culture supernatant in the TNF-α stimulation group were increased obviously,there being statisticaly significant difference between them(P<0.01);however,all above these parameters in the TNF-α plus ephedrine group showed decreased obviously as compared with the TNF-α group,the difference between them was statistically significant (P<0.01).ConclusionEphedrine can inhibit the expression and secretion of eotaxin in TNF-α induced 16HBE inflammatory model,which may be one of the mechanisms of Chinese medicine ephedra in treating asthma.

[Key words]ephedrine；asthma;bronchial epithelial cells；eotaxin

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.003

* 基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研項目(110341)。

作者簡介：李中燕(1986-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事支氣管哮喘的基礎(chǔ)與臨床研究。△通訊作者，E-mail：wang4816@sina.com。

[中圖分類號]R562.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1016-03

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-20)