李豫江,張　偉，趙　磊

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外二科，新疆石河子 832000；2.石河子大學醫(yī)學院生理教研室，新疆石河子 832000)

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來氟米特通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導大鼠系膜細胞凋亡的作用

李豫江1,張偉1，趙磊2△

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外二科，新疆石河子 832000；2.石河子大學醫(yī)學院生理教研室，新疆石河子 832000)

[摘要]目的探討來氟米特(A771726)對大鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響及可能機制。方法體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，分為正常對照組(加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)、A771726組(在對照組基礎上加入A771726，使其終濃度為50 μg/mL)、LY294002組(在正常對照組基礎上加入LY294002，使其終濃度為2 μg/mL)，LY294002+A771726組(先加2 μg/mL的LY294002干預系膜細胞4 h后，加入50 μg/mL的A771726)，采用流式細胞術檢測各組干預48 h后對大鼠腎小球系膜細胞凋亡的影響,采用免疫熒光法檢測各組干預48 h對大鼠系膜細胞中mTOR蛋白表達的影響，采用免疫印跡法檢測各組干預48 h后對大鼠系膜細胞中Caspase-3表達的影響。結果與正常對照組比較，A771726、LY294002、LY294002+A771726組大鼠腎小球系膜細胞的凋亡率均明顯升高，mTOR蛋白表達均明顯降低，Caspase-3蛋白表達均明顯增加；與A771726組比較，LY294002、LY294002+A771726組大鼠腎小球系膜細胞的凋亡率均明顯升高，mTOR蛋白表達均明顯降低，Caspase-3蛋白表達均明顯增加；與LY294002組比較，LY294002+A771726組大鼠腎小球系膜細胞的凋亡率明顯升高，mTOR蛋白表達明顯降低，Caspase-3蛋白表達明顯增加。結論來氟米特可能通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路而誘導大鼠腎小球系膜細胞的凋亡，且來氟米特可協(xié)同LY294002共同誘導大鼠系膜細胞的凋亡。

[關鍵詞]腎小球系膜細胞；來氟米特；細胞凋亡；PI3K/Akt/mTOR信號通路

資料顯示，我國慢性腎臟病的主要病因仍然是慢性腎小球腎炎，而其中又以系膜增生性腎小球腎炎的發(fā)病率最高。來氟米特(leflunomide，LEF)是一種新型免疫抑制劑，其藥理作用主要是口服后在胃腸道和肝臟分解代謝為活性代謝產(chǎn)物 A771726 而發(fā)揮藥理作用[1]。大量體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)：LEF具有抗炎、抗增殖、誘導細胞凋亡的作用[2-4]，但是具體機制不清楚。研 究 證 實PI3K/Akt/mTOR信號通路參與細胞的增殖、凋亡的調(diào)節(jié)，通過通路下游凋亡蛋白而誘導細胞的凋亡[5]。2013年12月至2014年10月本課題組通過觀察PI3K/Akt/mTOR信號通路在來氟米特對大鼠系膜細胞凋亡中的作用，從而為臨床上治療進展性腎小球腎炎提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1細胞株大鼠腎小球系膜細胞株(HBZY-1)購自武漢博士德生物工程有限公司，保持了正常大鼠系膜細胞的形態(tài)與功能。

1.1.2主要試劑來氟米特活性代謝產(chǎn)物 A771726 (Sigma公司)、LY2940002(Sigma公司)、低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、無支原體胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(Amresco公司)、AnnexinV-FITC凋亡試劑盒(Invitrogen公司)、PBS(上海生工生物)、兔抗大鼠mTOR單克隆抗體(Santa Cruz公司)、兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體(Santa Cruz公司)、羅丹明標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2儀器流式細胞儀(德國Partec公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(美國Thermo公司)、細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)、GEL-DOC2000凝膠電泳成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞培養(yǎng)方法參照趙丹等[6]的細胞培養(yǎng)方法。

1.3.2實驗分組收集對數(shù)期大鼠腎小球系膜細胞，計數(shù)后接種于培養(yǎng)板中，待細胞完全貼壁，棄完全培養(yǎng)基，加入無血清DMEM培養(yǎng)液同步化24 h，按實驗要求分為正常對照組(加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)、A771726組(在對照組基礎上加入A771726，使其終濃度為50 μg/mL)、LY294002組(在正常對照組基礎上加入LY294002，使其終濃度為2 μg/mL)，LY294002+A771726組(先加2 μg/mL的LY294002干預系膜細胞4 h后，加入50 μg/mL的A771726)，各組均干預48 h。各組加藥濃度和劑量根據(jù)本課題組前期預實驗和相關文獻報道而定。

1.3.3大鼠腎小球系膜細胞凋亡檢測細胞以1×105個/mL接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，按照實驗分組干預48 h，收集細胞，PBS洗滌2遍，嚴格按照AnnexinV-FITC凋亡試劑盒操作步驟，用流式細胞儀檢測各組人腎小球系膜細胞的凋亡，實驗重復3次。

1.3.4免疫熒光法檢測各干預組系膜細胞中mTOR蛋白的表達大鼠系膜細胞以2×104個/mL接種于提前放有無菌蓋玻片的24孔板內(nèi)，每孔1 mL，按照實驗分組干預培養(yǎng)48 h。48 h后取出細胞爬片，用PBS浸洗2次后，冷丙酮固定10 min，接著用10%正常山羊血清封閉液室溫封閉30 min。向蓋玻片細胞面滴加mTOR一抗(1∶100)，4 ℃濕盒孵育過夜。過夜后向蓋玻片細胞面滴加羅丹明標記山羊抗兔IgG，稀釋濃度為1∶100，室溫避光孵育2 h。最后用50%甘油緩沖液封片。每一步后均用PBS浸洗3次，每次5 min。最后用激光共聚焦顯微鏡觀察并掃面成像。

1.3.5免疫印跡法檢測各組干預48 h后Caspase-8蛋白的表達情況大鼠系膜細胞以1×106個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，按照實驗分組干預48 h后，用PBS洗滌2次，加入細胞裂解液，冰上靜置30 min后，12 000 r/min離心25 min，取上清液，統(tǒng)一蛋白濃度為10 g/L，100 ℃蛋白變性后待用。每孔每次加樣10 μL，在SDS-PAGE凝膠中電泳分離，半干轉法將蛋白從凝膠中轉移至PVDF膜上，4 ℃冰箱中用5%脫脂奶粉封閉3 h，加兔抗人Caspase-3單克隆一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶30 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜后加入化學發(fā)光試劑曝光，顯影、定影后將膠片置于凝膠成像分析儀進行定量分析，用同樣方法檢測β-actin內(nèi)參蛋白的表達。

2結果

2.1流式細胞術檢測各實驗組對大鼠系膜細胞凋亡的影響正常對照組大鼠系膜細胞的凋亡較少，其凋亡率為(2.66±0.34)%。與正常對照組比較，A771726、LY294002、LY294002+A771726組干預大鼠系膜細胞48 h后，其凋亡率均升高，凋亡率分別為(6.48±0.37)%、(6.64±0.37)%、(9.54±0.50)%，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與A771726組比較，LY294002組干預系膜細胞48 h后細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)，而LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LY294002組比較，LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

A:正常對照組;B：A771726(50 μg/mL)組;C:LY294002(2 μg/mL)組;D:LY2940002+ A771726組。

圖1各干預組作用系膜細胞48 h后對系膜細胞凋亡的影響

2.2免疫熒光法檢測各干預組系膜細胞中mTOR蛋白的表達情況與正常對照組比較，A771726、LY294002、LY294002+A771726組干預大鼠系膜細胞48 h后，mTOR熒光強度均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與A771726組比較，LY294002組干預大鼠系膜細胞48 h后，mTOR熒光強度無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后，mTOR熒光強度明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LY294002組比較，LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后，mTOR熒光強度亦明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1及圖2。

2.3免疫印跡法檢測各干預組系膜細胞中Caspase-3蛋白的表達情況與正常對照組比較，A771726、LY294002、LY294002+A771726組干預大鼠系膜細胞48 h后，Caspase-3蛋白表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與A771726組比較，LY294002組干預大鼠系膜細胞48 h后，Caspase-3蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后，Caspase-3蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LY294002組比較，LY294002+A771726組干預系膜細胞48 h后，Caspase-3蛋白表達亦明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2及圖3。

表1　各干預組作用系膜細胞48 h后對系膜細胞mTOR蛋白表達情況

▲：P<0.05，與正常對照組比較；□：P>0.05，■：P<0.05，與A771726組比較;★：P<0.05，與LY294002組比較。

A:正常對照組;B:A771726(50 μg/mL)組;C:LY294002(2 μg/mL)組;D:LY2940002+A771726組。

圖2各干預組作用系膜細胞48 h后系膜細胞mTOR蛋白表達情況(×100)

表2　各干預組作用系膜細胞48 h后系膜細胞Caspase-3蛋白表達情況

▲：P<0.05，與正常對照組比較;□：P>0.05，■P<0.05，與A771726組比較;★：P<0.05，與LY294002組比較。

N:正常對照組；A：A771726組；L：LY294002組；A+L:LY2940002+ A771726組。

圖3各干預組作用系膜細胞48 h后對系膜細胞Caspase-3蛋白表達情況

3討論

正常情況下，腎小球系膜細胞的增殖與凋亡均較少，且二者處于動態(tài)平衡。當外界細胞因子、炎癥介質(zhì)等持續(xù)作用下，系膜細胞增殖與凋亡的這種平衡將被打破，特別系膜細胞將大量增殖，而其凋亡將相應減少。研究發(fā)現(xiàn)，系膜細胞的凋亡又對腎小球損傷的修復起關鍵作用。因此，通過外界因素誘導系膜細胞凋亡，可能是控制和治療系膜增生性腎小球腎炎的重要靶點。

本研究通過體外培養(yǎng)正常大鼠腎小球系膜細胞，予以不同干預因素作用相同時間后，采用流式細胞術檢測大鼠系膜細胞凋亡，結果顯示：正常對照組大鼠系膜細胞凋亡率為(2.66±0.34)%。而與正常對照組比較，A771726(50 μg/mL)組大鼠系膜細胞的凋亡率從(2.66±0.34)%升高為(6.48±0.37)%，這說明來氟米特可明顯誘導大鼠系膜細胞的凋亡。大量研究發(fā)現(xiàn)：PI3K/Akt/mTOR 信號通路活化可以抑制多種細胞凋亡、促進細胞周期及細胞增殖，在細胞增殖與凋亡中起重要作用。張春江等[7]研究發(fā)現(xiàn)：大鼠系膜細胞中存在PI3K/Akt/mTOR 信號通路，且該通路與腎小球系膜細胞增殖與凋亡密切相關。而LY294002是PI3K特異性阻斷劑，其可特異性阻斷PI3K/Akt/mTOR 信號通路。本課題組應用LY294002干預大鼠系膜細胞48 h后，系膜細胞的凋亡率從(2.66±0.34)%升高為(6.64±0.37)%，而A771726組、LY294002組大鼠系膜細胞的凋亡率確無明顯差異，進一步在LY294002干預系膜細胞的基礎上，加用A771726，大鼠系膜細胞的凋亡進一步升高，這說明A771726誘導大鼠系膜細胞的凋亡可能是通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路實現(xiàn)的，且A771726可協(xié)同LY294002誘導大鼠系膜細胞的凋亡。

Caspases家族作為凋亡調(diào)節(jié)基因，在細胞中以無活性的酶原形式存在，當?shù)蛲鰴C制啟動后，形成具有活性的Caspase。Caspase-3被稱為劊子手胱天蛋白酶，無論是在內(nèi)在和外在的凋亡途徑中都有Caspase-3的激活，激活的Caspase-3將導致一些結構和調(diào)節(jié)蛋白的裂解從而引起細胞凋亡[8]。所以Caspases-3的表達增加，可以說標志著細胞內(nèi)凋亡機制的啟動。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照組中Caspase-3蛋白表達較低，而與正常對照組比較，A771726組、LY294002組中Caspase-3蛋白的表達明顯增加，然而與A771726組比較，LY294002組中Caspase-3蛋白的表達無明顯變化，而A771726聯(lián)合LY294002組中Caspase-3蛋白的表達較A771726組、LY294002組明顯增加，這進一步說明A771726可誘導大鼠系膜細胞的凋亡，且A771726可協(xié)同LY294002誘導大鼠系膜細胞的凋亡，因此筆者推測A771726誘導大鼠腎小球系膜細胞的凋亡可能是通過上調(diào)Caspase-3活性而實現(xiàn)的。

為進一步探討PI3K/Akt/mTOR 信號通路在A771726對大鼠系膜細胞凋亡中的作用，本實驗采用免疫熒光法檢測mTOR蛋白的表達，結果顯示：與正常對照組比較，A771726組mTOR熒光強度明顯減弱，而LY294002組mTOR熒光強度與A771726組無明顯差異，這說明A771726可能是通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 信號通路而誘導大鼠系膜細胞凋亡。而A771726聯(lián)合LY294002組mTOR熒光強度較A771726組、LY294002組明顯降低，這說明A771726可協(xié)同LY294002抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路。因此，筆者推測A771726可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，且其作用靶點可能是PI3K。

綜上所述，A771726可誘導大鼠腎小球系膜細胞的凋亡，其機制可能是通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 信號通路，且A771726可協(xié)同LY294002誘導大鼠系膜細胞的凋亡。

參考文獻

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Effect of leflunomide on rat mesangial cells apoptosis by PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

Li Yujiang1,Zhang Wei1,Zhao Lei2△

(1.Department of 2nd General Surgery,First Affiliated Hospital of the Medical College Shihezi University,Xinjiang 832000,China;2.Department of Physiology,Medical College of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of leflunomide(A771726) on the apoptosis of the rat glomerular mesangial cells and its possible mechanism.MethodsThe cultured rat glomerular mesangial cells were divided into the normal control group(adding DMEM culture solution containing 5% fetal calf serum),A771726 group(adding 50 A771726 on the basis of control group,making it a concentration as 50 μg/mL),LY294002 group (adding LY294002 on the basis of normal control group,making its final concentration as 2 μg/mL) and the LY294002+A771726 group(first adding 2 μg/mL LY294002 to interfere the mesangial cells for 2 h,then adding A771726 50 μg/mL).After 48 h intervention,its influence on mesangial cell apoptosis in each group were measured by flow cytometry.The expression of mTOR was measured by immunofluorescence.The expression of Caspase-3 was measured by Western-blot.ResultsCompared with the normal control group，the apoptosis rate of rat glomerular mesangial cells in the A771726 group,LY294002 group and LY294002+A771726 group were significantly increased,the expression of mTOR was decreased,the expression of Caspase-3 was increased;compared with the A771726 group,the apoptosis rates of rat glomerular mesangial cells in the LY294002 group and LY294002+A771726 group were significantly increased,the expression of mTOR was significantly decreased,the expression of Caspase-3 was significantly increased;compared with the LY294002 group,the apoptosis rate of rat glomerular mesangial cells in the LY294002+A771726 group was significantly increased,the expression of mTOR was significantly decreased,while the expression of Caspase-3 was significantly increased.ConclusionLeflunomide may induce the rat mesangial cells apoptosis through down-regulating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway，moreover,leflunomide may synergize with LY294002 to induce rat mesangial cells apoptosis.

[Key words]mesangial cells;leflunomide;cells apoptosis;PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.005

作者簡介：李豫江(1970-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤外科學研究。△通訊作者，E-mail:2446514472@qq.com。

[中圖分類號]R692

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1022-04

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-12-19)