趙書杰, 蔣羽清, 丁　寅, 張　強, 周　棟

(南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 常州, 213003)

?

沉默Sema6A基因?qū)侨饬黾毎鸘-2OS增殖和轉(zhuǎn)移的影響

趙書杰, 蔣羽清, 丁寅, 張強, 周棟

(南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 常州, 213003)

摘要:目的檢測信號素6A(Sema6A)基因在骨肉瘤細胞系中的表達情況，探討RNA干擾Sema6A基因?qū)侨饬鯱-2OS細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測骨肉瘤細胞株U-2OS、Saos-2及MG-63中Sema6A的mRNA表達水平。設計并合成針對Sema6A的小干擾RNA(siRNA)3條及陰性對照siRNA, 在Lipofectamine RNAiMAX介導下轉(zhuǎn)染U-2OS細胞，通過qRT-PCR檢測Sema6A mRNA水平表達及蛋白質(zhì)印跡法檢測Sema6A 蛋白水平，進而篩選出轉(zhuǎn)染效率高的siRNA，CCK-8檢測各組細胞活力，Transwell細胞侵襲和遷移實驗檢測各組細胞的侵襲及遷移能力。結果骨肉瘤細胞株中，Sema6A mRNA在U-2OS中表達最高。瞬時轉(zhuǎn)染Sema6A siRNA的U-2OS細胞中Sema6A的mRNA及蛋白水平較陰性對照組均下降，與陰性對照組相比，實驗組細胞的增殖、侵襲及遷移能力均增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論RNA干擾沉默Sema6A基因可以增強U-2OS細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

關鍵詞:Sema6A基因; RNA干擾; U-2OS細胞; 增殖; 轉(zhuǎn)移

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，起源于成骨間葉細胞，好發(fā)于青少年，惡性程度極高，約20%的患者在首診時即存在轉(zhuǎn)移灶，其中最常見的轉(zhuǎn)移部位為肺，預后較差[1]。根據(jù)國外文獻[2]的報道，骨肉瘤的發(fā)病年齡特點呈雙峰分布，11～20歲為骨肉瘤發(fā)病率的第1個高峰期，而第2個高峰期發(fā)生在65歲以后。骨肉瘤治療策略類似，包括新輔助化療、手術切除腫瘤并重建肢體功能以及術后化療的系統(tǒng)療法。發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年生存率僅僅為11%～29%[3]。Semaphorins是一個廣泛存在于各種生物體內(nèi)的蛋白超家族，最初是作為軸突導向分子而被發(fā)現(xiàn)[4], 在進化上是保守的。目前發(fā)現(xiàn)Semaphorin家族至少含有20多個成員，所有家族成員都具有一個保守的由約400個氨基酸組成的結構域[5]。研究[6]表明Sema家族的功能涉及到骨的重塑，參與了成骨細胞和破骨細胞間的信號傳遞。Sema家族中許多成員與腫瘤有著十分密切的關系，起著促進或者抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[7-10]。近年來，發(fā)現(xiàn)其家族成員 Sema6A參與了多種生物學進程，其可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、細胞遷移、形態(tài)變化及血管生成的過程。還有研究[11-15]表明Sema6A在韋格氏肉芽腫、黑色素瘤中有著重要的地位。本研究探討RNA干擾沉默Sema6A基因?qū)侨饬黾毎鸘-2OS增殖以及侵襲、遷移的影響，報告如下。

1材料與方法

1.1材料

人骨肉瘤U-2OS細胞株、Saos-2細胞株、MG-63細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。McCoy's 5a培養(yǎng)基、EMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國)；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Intivrogen公司，美國)；CCK-8(同仁公司，日本)；Transwell小室(Millipore公司，德國)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司，美國)；引物合成(上海生工生物工程有限公司)；Trizol 總RNA提取試劑(Intivrogen公司，美國)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料SYBR Premix EX Taq試劑盒(TaKaRa公司，日本)；SDS-PAGE凝膠試劑盒、結晶紫(中國碧云天生物技術研究所)β-actin一抗、Sema6A一抗(abcam公司，英國)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Intivrogen公司，美國)Sema6A siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。

1.2方法

siRNA序列設計合成以人Sema6A mRNA全長序列(NC000005.10)為RNAi的靶區(qū)設計 3 條 Sema6A siRNA 序列，同時設計陰性對照(NC)序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，具體序列見表 1。干粉 siRNA用DEPC水稀釋成20 μmol/L，-20 ℃保存。

表1　用于合成Sema6A siRNA的寡核苷酸序列

1.3細胞培養(yǎng)及 siRNA 轉(zhuǎn)染

人骨肉瘤U-2OS細胞采用含 10% FBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL青霉素的McCoy′s 5a培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。瞬轉(zhuǎn)干擾片段 siRNA 用DEPC水溶解并稀釋。干擾片段加125 μL的DEPC水，陰性對照加62.5 μL的DEPC水。取對數(shù)生長期U-2OS細胞，按 5×104個/孔接種于6孔板。次日按Lipofectamine RNAiMAX試劑說明書進行siRNA 轉(zhuǎn)染。細胞分為4組：陰性對照組( siRNA-NC)、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組。轉(zhuǎn)染8 h后換液，轉(zhuǎn)染后48 h提取mRNA, 72 h提取蛋白檢測干擾效率。

1.4實時熒光定量PCR檢測 siRNA 轉(zhuǎn)染對U-2OS細胞中Sema 6A mRNA表達的影響

siRNA轉(zhuǎn)染U-2OS細胞48 h后，用Trizol提取細胞總RNA，分別應用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料 SYBR Premix EX Taq試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和目的片段的擴增。內(nèi)參β-actin上游引物序列為: 5′-CTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′, 下游引物序列為: 5′- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′; Sema6A基因上游引物序列: 5′- ACATTGCTGCTAGGGACCATA -3′, 下游引物: 5′- TCTGCATGTGTCTACATCGGC -3′, 每組均設 3 個重復孔。PCR反應條件參照 TaKaRa PCR試劑盒說明書，以2-ΔΔCt表示目的基因 mRNA 的相對表達水平。

1.5Western blotting檢測Sema6A蛋白表達水平

siRNA轉(zhuǎn)染U-2OS細胞72 h后，IP裂解液各組細胞收集總蛋白。取等量總蛋白( 50 μg) 行 10% SDS PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗( Sema6A 抗體 1∶ 1 000 稀釋，GADPH 1∶ 1 000 稀釋) 4 ℃ 孵育過夜，次日TBS漂洗 10 min × 3，熒光二抗(1∶15 000 稀釋)室溫孵育45 min, TBS漂洗10 min × 3，進行圖像掃描，以Tif格式保存圖像并運用圖像分析軟件Image J分析條帶灰度值。

1.6CCK-8 法檢測Sema6A siRNA 轉(zhuǎn)染對U-2OS細胞增殖的影響

實驗分為siRNA-NC組、siRNA-6A組( siRNA-2、siRNA-3)，取對數(shù)期生長的U-2OS細胞，檢測前1 d, 在96孔板中接種轉(zhuǎn)染好的待測細胞(100 μL/孔)，每組設3個復孔，每孔接種4 000個細胞，向每孔中加入10 μL試劑，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h, 用酶標儀檢測450 nm處的吸光值作為零點，每天同一時間按上述步驟操作，連續(xù)檢測4 d, 繪制細胞生長曲線。

1.7Transwell遷移實驗檢測 Sema6A siRNA對U-2OS細胞遷移能力的影響

實驗分為siRNA-NC組、siRNA-2組、siRNA-3組，將U-2OS細胞按2.5×105個/孔接種于6孔板，按前述方法轉(zhuǎn)染各組siRNA。收集轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞，調(diào)整細胞密度至2.5×105/mL, 每上室加100 μL細胞懸液，下室加入700 μL含10% FBS的McCoy′s 5a培養(yǎng)基。根據(jù)預實驗結果培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS浸洗2次，用棉簽擦拭小室內(nèi)膜上附著的細胞, 1%戊二醛溶液固定30 min, 用PBS浸洗外膜2次，待干后0.1%結晶紫染色液染色15 min, 1×PBS洗3次，干燥后于正置顯微鏡觀察拍照。

1.8Transwell侵襲實驗檢測 Sema6A siRNA對U-2OS細胞侵襲能力的影響

實驗分為siRNA-NC組、siRNA-2組、siRNA-3組。制膠前所用槍頭、EP管、24孔板、小室等均先在冰上預冷，將Matrigel基質(zhì)膠與McCoy′s 5a培養(yǎng)基以1∶5稀釋，每小室鋪100 μL, 37 ℃ 放置2 h, 將U-2OS細胞按2.5×105個/孔接種于6孔板，按前述方法轉(zhuǎn)染各組siRNA。收集轉(zhuǎn)染后48 h各組細胞，調(diào)整細胞密度至5×105/mL, 每上室加100 μL細胞懸液，下室加入700 μL含10% FBS的McCoy′s 5a培養(yǎng)基，根據(jù)預實驗結果培養(yǎng)48 h, 余下步驟同細胞遷移實驗。

1.9統(tǒng)計學處理

所有實驗均獨立重復 3次。采用 SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Sema6A在骨肉瘤細胞系中的表達情況

檢測骨肉瘤細胞系中Sema6A mRNA的表達水平, qRT-PCR結果顯示3種骨肉瘤細胞系中均可檢測到Sema6A mRNA的表達，其中U-2OS細胞系表達水平最高(圖1)。以上結果提示Sema6A可能參與了骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展過程，同時作者選擇U-2OS細胞系作為后續(xù)實驗的細胞系。

圖1 Sema6A在3種骨肉瘤細胞株的mRNA的表達水平

2.2Sema6A siRNA 瞬時轉(zhuǎn)染U-2OS 細胞后Sema6A的 mRNA表達

siRNA轉(zhuǎn)染U-2OS細胞48 h后qRT-PCR檢測 Sema6A mRNA表達(圖2)，Sema6A siRNA組較NC組不同程度降低，干擾效率分別為siRNA-1(71.3±2.95)%、siRNA-2(85.1±1.91)%、siRNA-3(84.1±2.40)%，其中siRNA-2和siRNA-3組的mRNA相對表達量下降更顯著(P<0.05) 。

2.3Sema6A-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染U-2OS 細胞后Sema6A的蛋白表達

Western blotting(圖3)顯示, siRNA轉(zhuǎn)染后各組相對siRNA-NC組Sema6A蛋白表達水平不同程度下調(diào)。以上結果表明，3條Sema6AmRNA對 U-2OS細胞Sema6A表達均具有沉默效果，其中siRNA-2和siRNA-3干擾效率較高，與qRT-PCR結果一致，因此選取siRNA-2和siRNA-3序列作為有效序列進行下一步實驗。

圖2 Sema6AsiRNA在U-2OS細胞中的干擾效率

圖3 Sema6AsiRNA轉(zhuǎn)染促進U-2OS細胞的增殖

2.4Sema6A沉默促進U-2OS細胞的增殖

CCK8法檢測結果顯示在48、72及96 h時，siRNA-2和siRNA-3組的增殖情況均顯著高于siRNA-NC組(P<0.05)，該結果提示沉默Sema6A后可以促進骨肉瘤細胞系U-2OS的增殖。

2.5siRNA沉默Sema6A促進U-2OS細胞的侵襲及遷移

Transwell遷移實驗結果顯示, siRNA-2和siRNA-3組穿過濾膜的細胞數(shù)均顯著多于siRNA-NC組[(143.7±20.5)∶(40±8.0),P<0.05; (181.3±20.1)∶(40±8.0),P<0.05)]，該結果說明siRNA沉默Sema6A后可以增強U-2OS細胞的縱向遷移能力。Transwell侵襲實驗的結果提示siRNA-2和siRNA-3組穿過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)均顯著多于siRNA-NC組[(93.3±12.2)∶(25.3±6.1),P<0.05; (116.0±20.1)∶(10.6±6.1),P<0.05)]，該實驗結果提示siRNA沉默Sema6A后可以增強U-2OS細胞的侵襲能力。

3討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要發(fā)生部位位于長骨干骺端，僅少部分發(fā)生于中軸骨和骨盆。骨肉瘤不僅容易復發(fā)，而且早期轉(zhuǎn)移率很高，而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復發(fā)，往往預示著很差的預后[1]。中國骨肉瘤的發(fā)病率約為3/100萬，在骨肉瘤的傳統(tǒng)治療模式下，患者的5年生存率從20%提升到65%，但同時骨肉瘤的治療也遇到了瓶頸[16]。一些新的治療方法尚處于研究階段，比如基因治療、免疫治療及干細胞治療等[17]。本實驗利用siRNA瞬時干擾技術，沉默骨肉瘤細胞Sema6A的表達，觀察其對增殖、侵襲及遷移的影響。從多條設計序列中篩選了最有效序列，其干擾效果可達80%以上。siRNA沉默Sema6A表達后，轉(zhuǎn)染組骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯得到增強，表明Sema6A在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起到了一定的作用，促進腫瘤細胞自身的增殖與侵襲遷移。

Sema6A基因定位于人染色體的5q23-1，編碼的跨膜蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、細胞形態(tài)變化及血管生成的過程起到了重要的作用[12]。有研究[15]表明其與炎癥性疾病有著密不可分的關系。但是，當前對于Sema6A基因與腫瘤的研究仍處于起步階段，既往有研究報道Sema6A與黑色素瘤有著十分密切的關系。Loria等通過對黑色素瘤細胞系進行全基因組分析，篩選出了Sema6A，通過細胞功能發(fā)現(xiàn)沉默該基因后，可以導致BRAF突變的細胞株細胞骨架重塑，誘導細胞死亡[16-17]。而對于Sema6A與骨肉瘤的關系，國內(nèi)外尚無人研究。本實驗篩選了干擾效率較高的 Sema6A siRNA序列，同時發(fā)現(xiàn)siRNA靶向 Sema6A沉默增強骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。但是因為 siRNA 的短效性這一缺陷，只有通過建立sh-RNA及構建一個Sema6A基因敲除的老鼠模型，才能更好地驗證Sema6A可能作為一種潛在的抑癌基因而存在，并進一步闡明其在體內(nèi)的生物學功能。

參考文獻

[1]Ottaviani G, Jaffe N. The epidemiology of osteosarcoma[J]. Cancer Treat Res, 2009, 152: 3-13.

[2]Anninga J K, Gelderblom H, Fiocco M, et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand？[J]. Eur J Cancer, 2011, 47(16): 2431-2445.

[3]Bishop M W, Janeway K A, Gorlick R. Future directions in the treatment of osteosarcoma[J]. Curr Opin Pediatr, 2016, 28(1): 26-33.

[4]Kolodkin A L, Matthes D J, Goodman C S. The semaphorin genes encode a family of transmembrane and secreted growth cone guidance molecules[J]. Cell, 1993, 75(7): 1389-1399.

[5]Potiron V, Nasarre P, Roche J, et al. Semaphorin signaling in the immune system[J]. Adv Exp Med Biol, 2007, 600: 132-144.

[6]Worzfeld T, Offermanns S. Semaphorins and plexins as therapeutic targets[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(8): 603-621.

[7]Ch'ng E S, Kumanogoh A. Roles of Sema4D and Plexin-B1 in tumor progression[J]. Mol Cancer, 2010, 9: 251-259.

[8]Liu H, Yang Y, Xiao J, et al. Semaphorin 4D expression is associated with a poor clinical outcome in cervical cancer patients[J]. Microvasc Res, 2014, 93: 1-8.

[9]Jiang H, Qi L, Wang F, et al. Decreased semaphorin 3A expression is associated with a poor prognosis in patients with epithelial ovarian carcinoma[J]. Int J Mol Med, 2015, 35(5): 1374-1380.

[10]Mishra R, Thorat D, Soundararajan G, et al. Semaphorin 3A upregulates FOXO 3a-dependent MelCAM expression leading to attenuation of breast tumor growth and angiogenesis[J]. Oncogene, 2015, 34(12): 1584-1595.

[11]Dhanabal M, Wu F, Alvarez E, et al. Recombinant semaphorin 6A-1 ectodomain inhibits in vivo growth factor and tumor cell line-induced angiogenesis[J]. Cancer Biol Ther, 2005, 4(6): 659-668.

[12]Segarra M, Ohnuki H, Maric D, et al. Semaphorin 6A regulates angiogenesis by modulating VEGF signaling[J]. Blood, 2012, 120(19): 4104-4115.

[13]Okada A, Tomooka Y. A role of Sema6A expressed in oligodendrocyte precursor cells[J]. Neurosci Lett, 2013, 539: 48-53.

[14]Loria R, Bon G, Perotti V, et al. Sema6A and Mical1 control cell growth and survival of BRAFV600E human melanoma cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(5): 2779-2793.

[15]Xie G, Roshandel D, Sherva R, et al. Association of granulomatosis with polyangiitis (Wegener's) with HLA-DPB1*04 and SEMA6A gene variants: evidence from genome-wide analysis[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(9): 2457-2468.

[16]Ottaviani G, Jaffe N. The etiology of osteosarcoma[J]. Cancer Treat Res, 2009, 152: 15-32.

[17]Botter S M, Neri D, Fuchs B. Recent advances in osteosarcoma[J]. Curr Opin Pharmacol, 2014, 16: 15-23.

Effects of siRNA-mediated Semaphorin 6A silencing on proliferation and migration of human osteosaroma U-2OS cells

ZHAO Shujie, JIANG Yuqing, DING Yin, ZHANG Qiang, ZHOU Dong

(DepartmentofOrthopedics,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ABSTRACT:ObjectiveTo detect the expression of Semaphorin 6A gene in osteosaroma cell lines, and to explore the effect of RNA interference Sema6A gene on proliferation, invasion and migration of osteosaroma U-2OS cells. MethodsSmall inference RNA targeting different regions of Sema6A gene were transfected into U-2OS cells by Lipofectamine RNAimax. The most effective siRNA in knockdown Sema 6A was screened by quantitative PCR and Western blotting. The changes of cell proliferation, migration and invasion ability after Sema 6A knockdown were examined by CCK-8, Transwell cell invasion and migration assays. ResultsIn osteosaroma cell lines, mRNA Sema6A expressed the highest in U-2OS. The mRNA and protein levels of Sema6A in siRNA U-2OS cells by Transient transfection were significantly lower than the negative control group (P<0.05). Compared with the negative control group, proliferation, invasion and metastasis of cells in the experimental group increased significantly (P<0.05). ConclusionDown-regulation of Sema6A by siRNA can significantly enhance the proliferation and migration of U-2OS cells.

KEYWORDS:Sema6A gene; siRNA; U-2OS; proliferation; migration

中圖分類號:R 738.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-088-04

DOI:10.7619/jcmp.201609026

通信作者:周棟 E-mail: zhoudong1012@hotmail.com

收稿日期:2015-12-16