李　娟, 謝　靜, 李和蘭, 石培民, 孫愛寧

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬泰興市人民醫(yī)院 血液科, 江蘇 泰興, 225400;2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科, 江蘇省血液研究所 衛(wèi)生部血栓與止血重點實驗室, 江蘇 蘇州, 215000)

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EVI1基因陽性急性髓系白血病的臨床特點與預(yù)后分析

李娟1, 謝靜1, 李和蘭1, 石培民1, 孫愛寧2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬泰興市人民醫(yī)院 血液科, 江蘇 泰興, 225400;2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科, 江蘇省血液研究所 衛(wèi)生部血栓與止血重點實驗室, 江蘇 蘇州, 215000)

摘要:目的探討EVI1基因陽性急性髓系白血病(AML)患者的臨床特點、預(yù)后并與EVI1基因陰性AML患者進(jìn)行比較。方法觀察309例AML病例, 分析EVI1基因陽性AML患者的臨床特征、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、融合基因、早期死亡(ED)、CR率、總體生存率(OS)、無復(fù)發(fā)生存率(RFS)、造血干細(xì)胞移植效果等, 并與EVI1基因陰性AML患者進(jìn)行比較。結(jié)果EVI1基因陽性AML患者白細(xì)胞數(shù)顯著增高 (P<0.05), FAB分型中M4/M5比例偏高(P<0.05)。EVI1陽性患者的染色體核型主要為預(yù)后較差的11q23(MLL基因陽性)、inv(3)/t(3；3)、-7等重現(xiàn)性染色體異常, 而一些預(yù)后較好的核型如t(15；17)、t(8；21)、inv(16)發(fā)生率較低。EVI1基因陽性AML患者CR率明顯低于EVI1基因陰性者(54.3%∶74.1%)(P<0.05)。allo-HSCT可明顯提高EVI1基因陽性AML患者OS (P<0.05)。結(jié)論EVI1基因陽性AML白細(xì)胞數(shù)高, 生存期短, 化療效果差, 預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞:EVI1基因; 急性髓系白血病; 異基因造血干細(xì)胞移植

親嗜性病毒整合位點1(EVIl)基因定位于人類染色體3q26，編碼一個相對分子質(zhì)量 14.5 萬道爾頓的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，此轉(zhuǎn)錄因子是一個位點特異的 DNA 結(jié)合蛋白，定位于核，參與 RNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。EVI1基因主要控制胚胎的發(fā)育，對造血干細(xì)胞的增殖和存活起重要作用[1]。在白血病的發(fā)病中，EVI1 也是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子[2]。EVI1最初是作為一個常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入點在小鼠髓系白血病中被首次發(fā)現(xiàn)的[3]。在小鼠中，異常的EVI1表達(dá)引起髓系增生不良(包括增生過度和全血細(xì)胞減少)[4-5]。有研究[6]報道，EVI1陽性患者在初診AML中發(fā)生率大約為10%，在inv(3)(q21q26.2)或t(3；3)(q21；q26.2)異常的AML患者中，異常的EVI1表達(dá)是由3q26.2的EVI1基因座附近的斷裂點造成的，但在無上述染色體異位的AML中亦發(fā)現(xiàn)存在EVI1過表達(dá)[7]。作者收集了2011年1月—2013年12月住院治療的309例原發(fā)、初治AML病例，根據(jù)骨髓細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)、PCR檢測等確診，并根據(jù)EVI1基因檢測結(jié)果分為EVI1基因陽性組35例及EVI1基因陰性組274例，回顧性分析EVI1基因陽性患者基本臨床特征、治療效果、allo-HSCT對其預(yù)后的影響，并與EVI1基因陰性患者進(jìn)行比較，現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集2011年1月—2013年12月在蘇大一附院住院治療的初治AML病例共309例。其中男161例，女148例，男女比例1.1∶l。全部病例根據(jù)骨髓細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)、PCR檢測等確診。

1.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

全部病例的外周血及骨髓涂片經(jīng)瑞氏染色后閱片，并結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，進(jìn)行FAB分型。細(xì)胞化學(xué)染色包括：過氧化物酶、蘇丹黑、特異性酯酶、α-醋酸萘酚酯酶及氟化鈉抑制試驗、丁酸萘酚酯酶、過碘酸-雪夫、酸性磷酸酶染色。

1.3免疫表型檢測

治療前取骨髓液2～3 mL, 肝素抗凝，常規(guī)分離制備單個核細(xì)胞懸液。采用活細(xì)胞直接免疫熒光法單色標(biāo)記(美國BD公司產(chǎn)品)，F(xiàn)CM(美國BD公司)檢測。所用單抗檢測的抗原包括: ① 造血干/祖細(xì)胞表達(dá)抗原: HLA-DR、抗TdT、CD34; ② B細(xì)胞表達(dá)抗原：CD19、CD20、CD22、CD79a; ③ T細(xì)胞表達(dá)抗原: CD3、CD7、CD5、CD2、CD1a、CD4、CD8; ④ 髓系細(xì)胞表達(dá)抗原：CD13、CD33、CD15、CD11b、CD14、CD64、CD117、MPO、GlyA和CD56。上述單抗采用FITC、PE、APC、PerCP標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀檢測。方案參照歐洲白血病免疫學(xué)特征研究組(EGIL)提出的：髓系/巨核系/淋系抗原陽性細(xì)胞≥20%, CD34抗原陽性細(xì)胞≥10%[8]。

1.4細(xì)胞遺傳學(xué)分析

采集骨髓，肝素抗凝，分離單個核細(xì)胞。經(jīng)短期培養(yǎng)(24 h)后，按常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本，R顯帶，根據(jù)《國際人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名法(ISCN) 》[9]進(jìn)行核型分析。

1.5巢式RT-PCR檢測融合基因

收集患者骨髓標(biāo)本，采用全血RNA提取試劑盒提取RNA, 將RNA特異性反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 進(jìn)行巢式RT-PCR，應(yīng)用Life ProPCR儀進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，每輪均設(shè)置8組平行PCR, 使用1～8組多重PCR引物，引物參照文獻(xiàn)[7], 具體檢測的融合基因見表1。

表1　巢式RT-PCR檢測融合基因

1.6治療方案

1.6.1誘導(dǎo)及鞏固化療方案：非M3型60歲以下者采用IA方案(去甲氧柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷)為主要誘導(dǎo)方案，60歲以上者采用地西他濱+半量CAG方案(阿克拉霉素、Ara-C、粒細(xì)胞集落刺激因子)誘導(dǎo)化療，復(fù)發(fā)或難治的病例采用CAG、FLAG(氟達(dá)拉賓、Ara-C、粒細(xì)胞集落刺激因子)等方案，鞏固化療采用含中大劑量Ara-c為主的方案。M3型低中危患者采用亞砷酸、維甲酸雙誘導(dǎo)，高?；颊卟捎脕喩樗?、維甲酸聯(lián)合去甲氧柔紅霉素誘導(dǎo)。

1.6.2造血干細(xì)胞移植：達(dá)完全緩解(CR)的患者中，有移植適應(yīng)征的行異基因移植配型，根據(jù)供者來源不同，配型成功者接受同胞全相合、非血緣或單倍體相合的allo-HSCT。移植前采用改良BUCY方案進(jìn)行預(yù)處理。

1.7療效判定標(biāo)準(zhǔn)及隨訪

早期死亡(ED)[10]: 確診后未化療或化療開始后10 d內(nèi)死亡。CR、復(fù)發(fā)、OS、RFS定義見張之南等《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版[11]。隨訪資料來源于住院、預(yù)住院及門診病歷，自患者確診之日起進(jìn)行隨訪。死亡病例隨訪至死亡日，依病例記錄或?qū)颊呒覍匐娫捖?lián)系加以確認(rèn)；存活病例隨訪至2013年12月31日。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，針對患者不同類型資料選擇合適的統(tǒng)計學(xué)分析方法，計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗、Fisher確切概率法，OS、RFS生存分析采用Kaplan-Meier法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1臨床特征

EVI1基因重排陽性AML患者共35例(11.3%)，其中男19例，女16例，中位年齡44歲。按FAB分型M03例，M15例，M27例，M31例，M412例，M56例，M61例。EVI1基因陰性組患者274例，其中男145例，女129例，中位年齡45歲，按FAB分型M023例，M129例，M2113例，M322例，M449例，M533例，M65例。與EVI1基因陰性AML患者相比，EVI1基因陽性患者的白細(xì)胞數(shù)明顯增高 (P<0.05)，F(xiàn)AB分型中M4/M5比例偏高(P<0.05), 而年齡、性別、血紅蛋白、血小板二者對比無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　2組患者臨床資料比較[n(%)]

與EVI1陰性比較, *P<0.05。

2.2細(xì)胞遺傳學(xué)分析

35例EVI1基因陽性AML患者中，有27例(77.1%)檢測到克隆性染色體異常，其中11q23異常者7例(23%)，inv(3)/t(3；3)者5例(14%)，7號單體(-7)4例(11%)，復(fù)雜核型2例(6%)，t(15；17)者 1例(3%)，另有6例為其他染色體異常?？梢? EVI1與這些重現(xiàn)性染色體異常如11q23(MLL陽性)、inv(3)/t(3；3)、-7密切相關(guān)，而這些染色體異常在遺傳學(xué)分類中均為不良預(yù)后核型；相比較而言, EVI1在一些預(yù)后較好的核型如t(15；17)、t(8；21)、inv(16)中發(fā)生率較低。

2.3治療結(jié)果

35例EVI1基因陽性AML患者中, 1個療程獲CR者 13例，2個療程獲CR者 6例，總的緩解率54.3%, 其中早期死亡4例; 19例達(dá)CR患者中有9例進(jìn)行了allo-HSCT，存活6例，死亡3例。EVI1基因陰性AML患者中，1療程獲CR者 151例，2個療程獲CR者 52例，總的緩解率74.1%，其中早期死亡26例；203例達(dá)CR患者中有146例進(jìn)行了allo-HSCT。可見，EVI1基因陽性AML患者CR率明顯低于EVI1基因陰性患者(54.3%∶74.1%)(P<0.05)。為研究allo-HSCT對EVI1基因陽性AML患者預(yù)后的影響，將這35例EVI1基因陽性AML患者按治療方式分為allo-HSCT組和單純化療組，Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，allo-HSCT明顯提高了EVI1基因陽性AML患者OS (P<0.05)(圖1)。

圖1 EVI1基因陽性AML患者allo-HSCT方案和單純化療方案的OS比較

3討論

EVI1基因是一個具有DNA結(jié)合活性的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，該基因可與不同的蛋白如Smad3和CtBP形成復(fù)合體，調(diào)控一些信號通路中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄[24]。EVI1最初是作為一個常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入點在小鼠髓系白血病中被首次發(fā)現(xiàn)的。隨后，在髓系惡性腫瘤的染色體3q26重排的斷裂點區(qū)域發(fā)現(xiàn)了EVI1基因[25]?；虬袠?biāo)實驗表明EVI1在小鼠造血干細(xì)胞的增殖和維持中起關(guān)鍵作用，并且可參與白血病于細(xì)胞的產(chǎn)生[14]。盡管 EVI1基因早在 1988 年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，然而人們對其本質(zhì)了解并不多。

早期的研究[15]發(fā)現(xiàn)，EVI1 RNA的表達(dá)見于3號染色體異常，例如 t (3；3) ( q2l；q26 ) 或 inv (3 )(q2l；q26)。近期研究[16]表明，無3號染色體異常的白血病中也有EVI1的異常表達(dá)，在本研究中作者亦證實了這一結(jié)果: 35例EVI1基因陽性患者中，inv(3)/t(3；3)僅占14%, 許多患者表現(xiàn)為其他染色體異常。無3q26異常的白血病, EVI1基因過度表達(dá)的機(jī)制尚不明。Langabeer 等[17]觀察到?jīng)]有3q26異常的326例AML 11% EVI1表達(dá)陽性，認(rèn)為這些病例可能有隱含的3q26的重排，或是反映了向白血病轉(zhuǎn)化的造血前體細(xì)胞的EVI1表達(dá)狀態(tài)，也說明在AML白血病形成中EVI1的表達(dá)起重要作用。

本研究中作者發(fā)現(xiàn), EVI1基因陽性患者(35例)占AML患者(309例)的11.3%, Gilliland等曾假設(shè)AML的發(fā)生是由Ⅰ類和Ⅱ類突變共同導(dǎo)致的。Ⅰ類突變導(dǎo)致造血細(xì)胞增殖加速，而Ⅱ類突變可導(dǎo)致分化受阻和成熟障礙[18]。在許多其他類型AML的t(8；21)、inv(16)和c-kit等特別的突變存在者非隨機(jī)的相關(guān)性，證實了Gilliland的假設(shè)[19]。作者發(fā)現(xiàn)在這些EVI1基因陽性患者中，M0-M6型均可見EVI1基因表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，M4、M5型的EVI1基因陽性率高于其他亞型。因此，作者認(rèn)為，EVI1基因的表達(dá)可能發(fā)生于白血病形成的后期階段，其表達(dá)是一個繼發(fā)的過程而非原始啟動過程。對于EVI1在白血病形成中究竟發(fā)揮主導(dǎo)效應(yīng)還是輔助效應(yīng)，目前還不得而知。EVI1常與其它融合基因共表達(dá)，伴隨一些重現(xiàn)性染色體異常。該研究中, 35例EVI1基因陽性AML患者中，存在染色體異常者占77%, 主要為11q23異常、inv(3)/t(3；3)、7號單體以及復(fù)雜核型等不良預(yù)后核型，而諸如 t(15；17)、t(8；21)、inv(16)等預(yù)后良好核型的發(fā)生率較低，這也從另一個角度證實了EVI1基因陽性AML預(yù)后不良。

關(guān)于EVI1 基因的預(yù)后價值也是一個有爭論的話題。多數(shù)文獻(xiàn)報道 EVI1基因 異常表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[20], EVI1基因陽性患者的復(fù)發(fā)率高，療效差，生存期短，可能是AML患者預(yù)后不良的一個因素。亦有文獻(xiàn)[21]比較了3q26正常而EVI1基因陽性和陰性患者的無病生存和總生存期，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)而指出EVI1在AML中不能作為一個獨立預(yù)后因素。

近年來, HSCT被廣泛應(yīng)用于白血病等惡性血液病的治療，尤其是allo-HSCT的廣泛應(yīng)用成功挽救了大量患者的生命，甚至成為一些血液病唯一的根治方法。本研究將35例EVI1基因陽性AML患者分為allo-HSCT組和單純化療組，分析發(fā)現(xiàn)allo-HSCT明顯提高了EVI1基因陽性AML患者OS (P<0.05)，表明EVI1基因陽性AML患者接受allo-HSCT可提高其生存率，改善預(yù)后，是其治療的最佳手段。但由于本研究中EVI1基因陽性患者移植的病例數(shù)還較少，尚需今后大量移植病例來進(jìn)一步統(tǒng)計。

綜上所述，作者認(rèn)為EVI1基因陽性AML患者生存期短，化療效果差，預(yù)后不良，allo-HSCT可顯著改善其生存。因此，在初診AML患者中，EVI1的檢測顯得尤為重要，不僅可評估患者的預(yù)后，更好地進(jìn)行危險分層，而且對于治療手段的選擇也非常重要。對于EVI1基因陽性AML患者，達(dá)CR后盡快尋找合適的供體并行allo-HSCT對于改善其生存顯得非常重要。近來，有研究[22]認(rèn)為EVI1基因和CD52過表達(dá)密切相關(guān)，這可能成為CD52單克隆抗體治療的靶點。對于EVI1預(yù)后不良的機(jī)制以及研究新的治療此類患者的手段還需進(jìn)一步研究。

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Clinical characteristics and prognostic analysis of acute myeloid leukemia patients with positive expression of EVI1 gene

LI Juan1, XIE Jing1, LI Helan1, SHI Peimin1, SUN Aining2

(1.DepartmentofHematology,TaixingPeople′sHospitalAffiliatedtoYangzhouUniversity,Taixing,Jiangsu, 225400; 2.DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofSuzhouUniversity,KeyLaboratoryofThrombosisandHemostasisofMinistryofhealth,JiangsuInstituteofHematology,Suzhou,Jiangsu, 215000)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the clinical characteristics and prognosis of acute myoloid leukimia patients with positive expression of EVI1 gene. MethodsA total of 309 AML cases were retrospectively reviewed. The clinical features, cytomorphology, cytogenetics, early death, complete remission rate, overall survival, relapse-free survival and response to allo-HSCT of AML patients with EVI1 gene positive expression were investigated and compared with patients with EVI1 gene negative expression. ResultsCompared with the EVI1 gene negative expression group, the WBC in EVI1 gene positive expression AML patients increased significantly (P<0.05). Otherwise, the percentage of M4/M5 in these patients was higher according to FAB classification (P<0.05). EVI1 gene positive expression was associated with specific recurrent chromosome abnormalities, including 11q23(MLL gene rearrangement)、inv(3)/t(3；3), monosomy 7, while some favorable risk cytogenetics such as t(15；17), t(8；21)and inv(16) were almost exclusive. The AML patients with EVI1 gene positive expression had lower CR rate compared with EVI1 gene negative expression group (54.3% versus 74.1%)(P<0.05). Among patients with EVI1 gene positive expression, the cases received allo-HSCT had a higher OS (P<0.05). ConclusionCompared with EVI1 gene negative expression AML patients, the patient with EVI1 gene positive expression have higher WBC count, poor response to chemotherapy and poor prognosis.

KEYWORDS:EVI1 gene; acute myeloid leukemia; allo-hematopoietic stem cell transplantion

中圖分類號:R 733.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-032-05

DOI:10.7619/jcmp.201609009

通信作者:孫愛寧, E-mail: ainingsun@hotmail. com

收稿日期:2015-12-20