谷志杰, 張滿和, 周秀敏, 邢彥杰, 趙　昕, 張樹立

(1. 河北省唐山市樂亭縣醫(yī)院, 河北 樂亭，063600; 2. 河北省唐山工人醫(yī)院, 河北 唐山, 063000)

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右美托咪啶對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的影響

谷志杰1, 張滿和2, 周秀敏2, 邢彥杰2, 趙昕2, 張樹立2

(1. 河北省唐山市樂亭縣醫(yī)院, 河北 樂亭，063600; 2. 河北省唐山工人醫(yī)院, 河北 唐山, 063000)

摘要:目的探討右美托咪啶對創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的影響。方法采用改良自由落體裝置制備成年SD大鼠腦損傷模型，TBI后立即靜脈注射右美托咪啶15 μg/kg。采用神經(jīng)損傷評分評價(jià)運(yùn)動(dòng)功能，Morris水迷宮測試大鼠空間學(xué)習(xí)能力。LC3和NeuN的共定位。免疫印跡分析LC3的表達(dá)量。結(jié)果與TBI組比較，Dex組NSS差值顯著降低(P<0.05)。與sham組比較，TBI后所有大鼠在24、48 h逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。與TBI組比較，Dex組在48 h逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)。與TBI組比較，Dex組顯著抑制6、12、24 h的LC3Ⅱ上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論TBI后應(yīng)用右美托咪啶能顯著改善運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能，抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞自噬，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

關(guān)鍵詞:創(chuàng)傷性腦損傷; 右美托咪啶; 水迷宮; 自噬; 海馬區(qū); 神經(jīng)功能

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因[1-3]。右美托咪啶作為一種高效和高度選擇性的α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有催眠、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、交感神經(jīng)阻滯和止痛的功能，且不產(chǎn)生顯著的呼吸抑制[4-5]。大量研究[6-8]表明右美托咪啶對缺血性腦損傷能起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究探討右美托咪啶對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬的影響，報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物選擇

健康雄性SD大鼠120只，12～16周，體質(zhì)量340～370 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在12 h周期光照/黑暗環(huán)境中，在手術(shù)中或手術(shù)前后自由飲水?dāng)z食。

1.2顱腦損傷模型的制備

TBI的動(dòng)物模型由改良自由落體裝置制成[9]。將大鼠用戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉后中線切開局部皮膚，露出顱骨骨縫，將一個(gè)直徑10 mm、厚度3 mm鋼片以耳腦膠黏附到冠狀縫與矢狀縫交點(diǎn)處。將動(dòng)物移至自由落體裝置下一個(gè)海綿墊上，450 g銅錘通過1.5 m的垂直管自由落下打擊鋼片，造成大鼠彌漫性腦損傷。sham組動(dòng)物接受相同的手術(shù)，但不接受重錘沖擊。手術(shù)后的大鼠消毒縫合頭皮后，安置在單獨(dú)的籠子里，放有37 ℃的熱墊，使其在24 h恢復(fù)期維持正常體溫。

1.3分組與用藥

120只大鼠被隨機(jī)分為sham組、TBI組和Dex組。3組又細(xì)分為4個(gè)亞組，每亞組10只大鼠。各亞組10只大鼠分別在創(chuàng)傷性腦損傷后6、12、24和48 h處死。Dex組大鼠在創(chuàng)傷性腦損傷后立即靜脈注射右美托咪啶15 μg/kg(江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，20120425)。

1.4運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及空間學(xué)習(xí)能力

采用神經(jīng)功能缺損程度評分(NSS)評價(jià)大鼠的神經(jīng)功能狀態(tài)，包括測試反應(yīng)、警覺性、協(xié)調(diào)、運(yùn)動(dòng)能力。10分代表神經(jīng)功能損害最大，0分代表神經(jīng)功能正常[11]。損傷24、48 h后分別由1名并不知情的人員進(jìn)行NSS測試。計(jì)算每只大鼠最初和后續(xù)時(shí)間段NSS差值，該差值反映大鼠自發(fā)或由治療引起的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

空間學(xué)習(xí)記憶能力的評估在Morris水迷宮內(nèi)進(jìn)行。術(shù)前所有大鼠經(jīng)科學(xué)、有序地訓(xùn)練使它們找到安全島的時(shí)間無差異。在每一個(gè)試驗(yàn)中，大鼠被隨機(jī)放入一個(gè)象限開始點(diǎn)(N、S、E或W)，面向池壁，允許其60 s內(nèi)逃到一個(gè)平臺，如果未在90 s內(nèi)找到安全島，則回籠等待下一次實(shí)驗(yàn)。計(jì)算5個(gè)試驗(yàn)的平均逃避潛伏期。該測試在傷后24、48 h進(jìn)行。

1.5分析方法

蛋白質(zhì)印跡分析：將大鼠深度麻醉后進(jìn)行灌注固定。海馬CA1區(qū)被迅速隔離；總蛋白被提取出來，蛋白濃度通過BCA試劑(Solarbio，北京)測定。樣品進(jìn)行凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Roche Diagnostics公司，曼海姆，德國)。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。滴加兔抗大鼠的LC3多克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜，洗膜后加羊抗兔的二抗(1∶6 000)室溫孵育2 h，ECL顯色并曝光，軟件分析其條帶的灰度值。

免疫熒光分析：將腦組織在4%的多聚甲醛中固定24 h, 注入30%的蔗糖溶液中(0.1 mol/L PBS, pH 7.4)，TBI大鼠海馬區(qū)由前向后被切成每個(gè)部分相距200 μm薄片，OCT包埋。0.4%的Triton-X100打孔10 min, 驢血清封閉1 h。滴加兔抗-LC3多克隆抗體(1∶100)和抗神經(jīng)元細(xì)胞核多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司；圣克魯斯，CA，USA，1∶100稀釋)的混合物在4℃孵育過夜。滴加二抗37℃避光孵育2 h。照片放在激光掃描共聚焦顯微鏡中(Olympus FV1000)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

TBI組和Dex組24、48 h的NSS差值分別為(5.2±0.4)、(4.6±0.5)和(2.4±0.3)、(1.6±0.2)，Dex組NSS差值顯著低于TBI組(P<0.05)，表明右美托咪啶能減輕腦外傷引起的運(yùn)動(dòng)障礙，有助于創(chuàng)傷性腦損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。同時(shí)，sham組，TBI組和Dex組24、48 h的逃避潛伏期分別為(17.5±2.1)、(16.9±2.3)和(58.7±6.5)、(52.1±5.0)和(51.2±4.7)、(40.8±4.1)。TBI組和Dex組逃避潛伏期顯著長于sham組(P<0.05)，且TBI組逃避潛伏期顯著長于Dex組(P<0.05)。

24 h后觀察TBI組LC3和NeuN共定位的雙重免疫熒光染色，LC3被兔抗LC3抗體著色，第二抗體顯示綠色。同時(shí)，神經(jīng)元細(xì)胞被小鼠抗NeuN抗體著色，第二抗體顯示紅色。合并后激光共聚焦顯微鏡觀察到黃色，表明大多數(shù)LC3主要分布于神經(jīng)元。LC3 Ⅱ蛋白的表達(dá)通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)，sham組LC3Ⅱ蛋白在海馬區(qū)低水平表達(dá)。TBI后6 h的LC3Ⅱ蛋白在海馬表達(dá)顯著增加，24 h后達(dá)到最大值。與TBI組比較，Dex組顯著抑制6、12、24 h的LC3Ⅱ上調(diào)。見圖1。

圖1 3組LC3和NeuN共定位的雙重免疫熒光染色比較

3討論

海馬是一種被廣泛研究的與空間記憶相關(guān)的結(jié)構(gòu)。數(shù)年來，Morris水迷宮已被廣泛用于嚙齒動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)能力研究[12]。神經(jīng)系統(tǒng)程度評分和Morris水迷宮的結(jié)果都表明，在腦外傷后單次注射右美托咪啶能顯著改善運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)功能。這些結(jié)果表明右美托咪啶對腦外傷大鼠起到了神經(jīng)性保護(hù)作用。

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)蛋白和細(xì)胞器的主要降解過程，是一種自我平衡機(jī)制。LC3是自噬誘導(dǎo)的最可靠的生物標(biāo)志物。作者發(fā)現(xiàn)大鼠TBI后從LC3Ⅰ到Ⅱ轉(zhuǎn)化的生化證據(jù)。此外，采用免疫組化和激光共聚焦方法研究LC3的分布。共聚焦顯微鏡下，作者發(fā)現(xiàn)損傷海馬區(qū)神經(jīng)元的LC3免疫染色增強(qiáng)[13]。免疫印跡分析表明，LC3Ⅱ水平在TBI后6～24 h顯著升高。這些結(jié)果表明，TBI后自噬被激活。作者先前的研究表明，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷后自噬被高度誘導(dǎo)[14]。右美托咪啶能部分抑制創(chuàng)傷引起的LC3Ⅱ免疫反應(yīng)，表明自噬參與右美托咪啶引起的神經(jīng)保護(hù)。因此，作者推測右美托咪啶對腦損傷的神經(jīng)保護(hù)與海馬區(qū)自噬抑制相伴。本研究結(jié)果表明，右美托咪啶能夠抑制神經(jīng)元的自我吞噬，有效提高受到腦損傷的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的存活率，改善運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

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Effect of dexmedetomidine on hippocampal neuronal autophagy of rats with traumatic brain injury

GU Zhijie1, ZHANG Manhe2, ZHOU Xiumin2, XING Yanjie2,ZHAO Xin2, ZHANG Shuli2

(1.TheHospitalofLaotingCounty,Laoting,Hebei, 063600; 2.TangshanWorker′sHospital,Tangshan,Hebei, 063000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of dexmedetomidine (Dex) on hippocampal neuronal autophagy of rats with traumatic brain injury (TBI). MethodsThe modified free fall device was used to prepare models of adult SD rats with TBI, and 15 μg/kg Dex was administered immediately after TBI. Motor function was assessed by Neurologic Severity Score (NSS), and the spatial learning ability was evaluated by Morris water maze. The co-localization of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3) and neuronal nuclei (NeuN) was made. Expression of LC3 was detected by Western blot analysis. ResultsCompared with TBI group, the NSS score decreased significantly in Dex group (P<0.05). Compared with sham group, escape latency at 24, 48 h in all rats after TBI increased significantly (P<0.05). Compared with TBI group, escape latency at 48 h significantly decreased in Dex group (P<0.05). Compared with TBI group, the up-regulations of LC3 at 6, 12 and 24 h were significantly inhibited in Dex group (P<0.05). ConclusionApplication of Dex after TBI can significantly improve motor and cognitive functions, inhibit hippocampal neuronal autophagy and promote the recovery of neural function.

KEYWORDS:traumatic brain injury; dexmedetomidine; Morris water maze; autophagy; hippocampus; neural function

中圖分類號:R 651.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)09-014-03

DOI:10.7619/jcmp.201609004

通信作者:張滿和, E-mail: zhangmanhe01@163.com

收稿日期:2015-10-21