劉振峰，劉新梅，方　銳，艾力江·阿斯拉，鄧迎杰，宋玉成

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

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買朱尼對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用研究

劉振峰，劉新梅，方銳，艾力江·阿斯拉，鄧迎杰，宋玉成

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

[摘要]目的觀察維藥買朱尼對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，探討買朱尼對軟骨細胞的保護作用機制。方法將30只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和買朱尼組，每組10只。模型組和買朱尼組采用改良Hulth造模法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型，建模第2周開始買朱尼組灌胃買朱尼10.31 mg/(kg·d)，模型組和假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)4周。末次灌胃后24 h取3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標本進行大體評分和組織學評分，采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a的表達水平。結(jié)果模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標本大體評分、軟骨組織學Mankin評分及軟骨細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a蛋白及mRNA表達水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，而買朱尼組均明顯低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論維藥買朱尼可以減輕大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的程度，其可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮保護關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用。

[關(guān)鍵詞]骨性關(guān)節(jié)炎；維藥買朱尼；Wnt/β-catenin通路

骨性關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于老年人的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨漸進性和退行性病變?yōu)橹饕卣?，嚴重影響患者下肢運動功能及生活質(zhì)量[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制較為復雜，涉及多條信號通路，其中Wnt/β-catenin通路在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。Wnt信號通路在多種生理/病理過程中發(fā)揮作用，包括生物體的生長、發(fā)育、疾病、衰老等，也包括細胞增殖、分化、凋亡、應激、免疫等[3-5]。維藥買朱尼是二級干熱蜜膏制劑，具有補益腦腎、緩解疼痛、活血、燥濕等作用，適用于外來寒邪因素引發(fā)的非體液型寒性氣質(zhì)失調(diào)疾病。買朱尼中主要成分西紅花有強健筋骨、醒神益智、暖體通阻的功效，對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有顯著的治療效果[6]。本實驗通過構(gòu)建骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究了維藥買朱尼對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，旨在從分子水平探討買朱尼對軟骨細胞的保護作用機制。

1實驗資料

1.1藥物維藥買朱尼成分包括巴旦杏仁、阿月渾子、肉豆蔻、胡椒、姜/桂皮、坷子皮、毛坷子、余甘子、歐白芨各15 g，蜂蜜2倍量，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院提供。

1.2實驗動物雄性健康清潔級SD大鼠30只，鼠齡2個月，體質(zhì)量(250±10)g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(新)2013-0032。復合飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為60%。實驗過程中對動物處置符合動物實驗倫理學要求。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組、模型構(gòu)建及藥物處理將30只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和買朱尼組，每組10只。采用改良Hulth造模法[7]建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型：將大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后不固定傷肢，自由活動，可適當給予抗生素預防感染。手術(shù)7 d后驅(qū)趕動物，每日30 min，分2次驅(qū)趕，驅(qū)趕4周后即得明顯的骨性關(guān)節(jié)炎模型。買朱尼組從建模第2周開始灌胃買朱尼，根據(jù)人鼠體質(zhì)量換算出服藥量為10.31 mg/(kg·d)[8]，假手術(shù)組和模型組均灌胃等量生理鹽水，均持續(xù)4周。

1.3.2標本大體觀察末次灌胃后24 h采用CO2安樂死法處死大鼠[9]，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨并根據(jù)文獻[10]標準進行評分：0分，關(guān)節(jié)面光滑；1分，關(guān)節(jié)面粗糙；2分，關(guān)節(jié)面糜爛；3分，關(guān)節(jié)面潰瘍；4分，軟骨剝脫。

1.3.3軟骨組織學評分固定股骨內(nèi)側(cè)髁，放入硝酸進行脫鈣，用刀片取軟骨組織，并經(jīng)乙醇、二甲苯脫水至透明，石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察并對標本進行改良Mankin評分[11]。

1.3.4軟骨細胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a mRNA表達檢測將大鼠軟骨組織加入1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，抽提細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件：2 μg RNA,1 μL 0.5 μg/μL Oligo(dT)Primer (Promega Corp),1 μL 10 mmol/L dNTP Mix,5 μL M-MLV 5X Reaction Buffer和1 μL 200 IU/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(終體積25 μL)。使用Primer 5.0軟件設計引物，Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’ ACCATTCGGCTAAACGGTC，下游引物：5’- CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β-5上游引物：5’- GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’；GAPDH上游引物：5’-TGCTGAGTATGTTTCTTGCC-3’，下游引物：5’-GTCTTCTGAGTGGGCAT-3’。Real time PCR擴增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.3.5軟骨細胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a 蛋白表達檢測采用Western blot 法檢測。 剝離大鼠軟骨組織，抽提細胞總蛋白，BCA方法進行蛋白濃度鑒定。各取20 μL樣品(含10 μg總蛋白)進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，與封閉液室溫孵育2 h后分別與兔抗鼠β-catenin、Wnt-3a、GSK-3β、GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔多克隆二抗IgG(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，NE，USA)檢測蛋白信號，采用軟件Odyssey system application進行蛋白表達定量分析，GAPDH作為內(nèi)參。所有使用抗體均購自美國Santa cruz公司。

1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，用均數(shù)±標準差表示，大體評分采用秩和檢驗，其余檢測采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標本大體評分情況模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標本大體評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，買朱尼組大鼠軟骨標本大體評分明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標本大體評分情況　　只

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學評分假手術(shù)組改良Mankin評分為(0.56±0.35)分，模型組為(2.86±1.27)分，買朱尼組為(1.37±1.01)分。模型組改良Mankin評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，買朱尼組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達水平模型組中軟骨細胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，買朱尼組β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞β-catenin、GSK-3β和

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達水平模型組中軟骨細胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，買朱尼組β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖1及表3。

3討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一種退行性病變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、丟失、纖維化、潰瘍及骨贅形成，可以繼發(fā)于畸形性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等影響關(guān)節(jié)軟骨或造成關(guān)節(jié)負重不平衡的骨關(guān)節(jié)疾病，目前其發(fā)病機制尚不清楚。在全球逐步進入老齡化社會的背景下，骨性關(guān)節(jié)炎因其患病率高、危害性大，已成為備受關(guān)注的、十分嚴重的公共健康問題。近年來有學者發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路對細胞增殖、分化、凋亡、衰老等具有調(diào)節(jié)作用，并參與骨代謝相關(guān)疾病的發(fā)病過程[12-14]。為證明Wnt信號在軟骨細胞基質(zhì)分解代謝中的作用，Yuasa等[15]采用Wnt-3a刺激兔關(guān)節(jié)軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶3和金屬蛋白酶13的表達增強，并且促進了IL-1β引起的蛋白多糖基質(zhì)丟失。Blom等[16]發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨細胞中Wnt-16和Wnt2β的表達水平顯著上升，并進一步誘導關(guān)節(jié)組織中MMPs和聚蛋白多糖酶的表達，從而導致關(guān)節(jié)軟骨的損傷。Wnt通路中關(guān)鍵分子包括β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a，其中β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心分子，上游分子傳遞的信號均需通過β-catenin才能發(fā)揮作用。Corr[17]在退變的軟骨細胞內(nèi)觀察到β-catenin表達顯著增加，從而推斷Wnt信號通路的激活與軟骨丟失有關(guān)。Johlrson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達明顯上升，其過度表達在骨性關(guān)節(jié)炎形成中起重要作用。GSK-3β是軸蛋白(Axin)的關(guān)鍵組成部分，通過磷酸化β-catenin 使細胞質(zhì)內(nèi)β-catenin維持低水平[19]。

圖1　各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞β-catenin、

組別nβ-cateninGSK-3βWnt-3a假手術(shù)組101.051±0.2351.003±0.4850.969±0.236模型組103.792±0.861①2.692±1.035①2.681±1.264①買朱尼組101.458±0.658②1.364±0.482②1.956±0.529②

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

近年來許多學者開展了中藥復方及提取物對Wnt信號通路干預的相關(guān)研究，并取得了一些進展。二級干熱蜜膏制劑買朱尼具有緩解疼痛、開通阻滯、強筋健骨、燥濕、活血等功效，其可以調(diào)節(jié)IL-1β誘導的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)金屬蛋白酶1/13及其組織抑制因子Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達，對骨性關(guān)節(jié)炎有潛在的治療價值[20-21]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，維藥買朱尼可以顯著降低軟骨大體評分及 Mankin評分，降低軟骨細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a的mRNA和蛋白表達水平。提示買朱尼可以減輕大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的程度，其可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮保護關(guān)節(jié)軟骨細胞的作用。

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Effects of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models

LIU Zhenfeng, LIU Xinmei, FANG Rui, AI Lijiang·Asila, DENG Yingjie, SONG Yucheng

(Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi 830000, Xinjiang, China)

Abstract:Objective It is to study the regulatory function of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models. Methods Knee osteoarthritis model was constructed using modified Hulth method. 30 healthy SD rats were randomly divided into sham group, model group and Maizhuni group with 10 rats in each group. From the second week, rats were administered with Uygur medicine Maizhuni (10.31 mg/(kg·d)) or saline by gavage for 4 weeks. General scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage in the three groups were evaluated. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to determine the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3a in the Wnt/β-catenin pathway. Results Compared to the sham group, the general scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was significantly increased. Compared to the model group, the degree of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was obviously alleviated. The cartilage general score and Mankin score in Maizhuni group was lower than that in the model group (P<0.05). On the molecular lever, we found that Maizhuni treatment significantly reduced the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3 in the knee joint chondrocytes (P<0.05). Conclusion Uygur medicine Maizhuni could protect the articular cartilage by regulation of Wnt/β-catenin pathway.

Keywords:osteoarthritis, Uygur medicine Maizhuni, Wnt/β-catenin pathway

[收稿日期]2015-07-01

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)07-0690-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.07.002

[基金項目]新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(2013721040)

[作者簡介]劉振峰，男，碩士，主治醫(yī)師，助理研究員，主要從事骨代謝性疾病的研究。[通信作者]方銳，E-mail：85681924@qq.com