張　瑩，周小莉，戴　敏，吳　斌

(重慶市中醫(yī)院，重慶 400021)

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小柴胡湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-17、IL-23及IL-27的影響

張瑩，周小莉，戴敏，吳斌

(重慶市中醫(yī)院，重慶 400021)

[摘要]目的觀察小柴胡湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、小柴胡湯低劑量組和小柴湯高劑量組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠采用注射Ⅱ型膠原乳化劑的方法建立CIA模型。于首次注射Ⅱ型膠原乳化劑2周后開(kāi)始，雷公藤多苷組給予雷公藤多苷20 mg/(kg·d)灌胃，小柴胡湯低、高劑量組分別給予小柴胡湯9 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)灌胃，正常組給予等量生理鹽水灌胃，均連續(xù)4周。測(cè)量建模1周、2周后和灌胃1周、2周、4周后大鼠關(guān)節(jié)左右徑和前后徑，計(jì)算灌胃前和灌胃1周、2周、4周后關(guān)節(jié)炎指數(shù)，灌胃4周后采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平。結(jié)果各給藥組灌胃后踝關(guān)節(jié)腫脹程度均明顯輕于模型組(P均<0.05)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL- 17、IL- 23、IL-27水平，可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]小柴胡湯；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；IL-17；IL-23；IL-27

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因不明的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，細(xì)胞因子的異常表達(dá)及相互作用在RA關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞方面起重要作用[1]。隨著人們對(duì)RA認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Th17/Treg細(xì)胞比率失衡在RA發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]，而IL-6、IL-23、IL-17和IL-27等相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)與其比率失衡有密切關(guān)系[4-5]。RA屬于中醫(yī)痹證范疇，中醫(yī)少陽(yáng)治痹古今有之，小柴胡湯是張仲景治療傷寒病見(jiàn)少陽(yáng)證的代表方劑。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠有顯著的抗炎作用[6]，而對(duì)于新的臨床應(yīng)用，則需要更多的藥理研究作為基礎(chǔ)。故本研究通過(guò)觀察小柴胡湯對(duì)CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平的影響，探討其作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1動(dòng)物SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào)：20120011)，籠中鼠顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2試劑牛Ⅱ型膠原(奧多福尼生物科技，中國(guó))，不完全弗氏佐劑(Sigma，美國(guó))，IL-17、IL-23、IL-27 ELISA檢測(cè)試劑盒(Roche，瑞士)，水合氯醛(Life technologies，美國(guó))，冰醋酸(生工生物，中國(guó))。

1.1.3藥物雷公藤多苷片,遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司提供，用時(shí)用蒸餾水溶解稀釋；小柴胡湯組方：柴胡24 g、黃芩9 g、半夏9 g、生姜9 g、黨參9 g、甘草9 g、大棗12 g，各味藥均由重慶市中醫(yī)院藥劑科提供飲片并煎制，濃縮液含生藥2 g/mL。

1.2方法將Wistar大鼠40只隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、小柴胡湯低劑量組和小柴胡湯高劑量組，每組8只。除正常組外，其余4組大鼠均建立CIA模型：用0.1 mmol/L醋酸10 mL溶解Ⅱ型膠原蛋白40 mg(4 ℃過(guò)夜)，再與10 mL的不完全弗氏佐劑均勻混合，于冰浴中充分乳化。在無(wú)菌條件下在大鼠尾根及背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，初次免疫共注射乳劑0.2 mL，1周后予以加強(qiáng)免疫，同法再注射乳劑0.2 mL。初次免疫2周按關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分，AI>4分證明造模成功。之后小柴胡湯低劑量組給予小柴胡湯9 g/(kg·d)(通過(guò)成人用藥劑量與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥量換算公式換算而得)灌胃，小柴胡湯高劑量組給予小柴胡湯18 g/(kg·d)灌胃，雷公藤多甙組給予雷公藤多甙液20 mg/(kg·d)灌胃，正常組給予等量生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)4周。

1.3觀察項(xiàng)目

1.3.1關(guān)節(jié)腫脹程度游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠雙后肢踝關(guān)節(jié)下緣左右徑和前后徑，每周1次。

1.3.2AI每周采用關(guān)節(jié)評(píng)分法對(duì)每只大鼠足爪關(guān)節(jié)進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算AI[3]。評(píng)分方法：0分為無(wú)紅腫；1分為趾關(guān)節(jié)稍腫，足爪或足墊單個(gè)區(qū)域炎癥；2分為關(guān)節(jié)輕度紅腫，足爪和足墊或踝關(guān)節(jié)2個(gè)區(qū)域以上的炎癥；3分為關(guān)節(jié)中度紅腫，輕度功能障礙；4分為關(guān)節(jié)重度紅腫，僵直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙。得分最高16分。

1.3.3血清IL-17、IL-23、IL-27水平灌胃4周后，從各組大鼠的球后靜脈叢取血，凝固后離心取血清，于-80 ℃冰箱保存。ELISA法測(cè)定血清IL-17、IL-23、IL-27水平。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)正常組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體質(zhì)量增加，精神狀態(tài)好，鼠毛有光澤，行動(dòng)自如，無(wú)異常狀態(tài)出現(xiàn)；模型組大鼠食欲減退，體質(zhì)量逐漸下降，精神萎靡，鼠毛失去光澤，行動(dòng)遲緩；給藥后大鼠食欲逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量有所增加，行動(dòng)較前自如，精神狀態(tài)有所恢復(fù)。

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度模型組建模2周后大鼠雙后肢左右徑、前后徑均明顯長(zhǎng)于正常組(P均<0.05)。灌胃2周、4周后，各給藥組大鼠雙后肢左右徑及前后徑均明顯短于模型組 (P均<0.05)。小柴胡湯高、低劑量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1及表2。

2.3各組大鼠AI比較灌胃2周、4周后各給藥組大鼠AI均明顯低于模型組(P均<0.05)；灌胃4周后小柴胡湯高劑量組AI明顯低于小柴胡湯低劑量組(P<0.05)，小柴胡湯高劑量組與雷公藤多苷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平比較灌胃4周后，模型組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組(P均<0.05), 而小柴胡湯高劑量組與雷公藤多甙組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4。

3討論

表1　各組大鼠不同時(shí)間關(guān)節(jié)左右徑比較±s，mm)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2　各組大鼠不同時(shí)間關(guān)節(jié)前后徑比較±s，mm)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表3　各組大鼠不同時(shí)間AI比較±s，分)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與小柴胡湯低劑量組比較，P<0.05。

表4　各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與小柴胡湯低劑量組比較，P<0.05。

RA以關(guān)節(jié)慢性炎癥及關(guān)節(jié)破壞為主，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形而致殘。最新研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞的抑炎作用及Th17細(xì)胞的促炎作用與RA發(fā)病密切相關(guān)，RA患者外周血Th17細(xì)胞比率明顯增加，Treg細(xì)胞比率降低，最終導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞比率失衡，其可能與RA的發(fā)生發(fā)展及活動(dòng)性有關(guān)[7-8]。

IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，其能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在RA的發(fā)病過(guò)程及治療中發(fā)揮著重要作用[9]。IL-17發(fā)揮致炎作用的途徑主要是通過(guò)誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子以及趨化因子的表達(dá)，使炎癥細(xì)胞侵入關(guān)節(jié)局部組織而造成損[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在RA患者血清及關(guān)節(jié)液中表達(dá)很高，其在RA發(fā)病中的作用主要表現(xiàn)在多種炎性細(xì)胞因子從滑膜細(xì)胞釋放，軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成受到抑制，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，最終引起骨侵蝕[11]。最新研究報(bào)道，對(duì)于RA的治療，阻斷TNF-α及IL-17對(duì)于抑制細(xì)胞因子、趨化因子及基質(zhì)酶的表達(dá)有非常重要的作用[12]。

IL-23是2000年發(fā)現(xiàn)并命名的IL-12家族成員，為異二聚體結(jié)構(gòu)。IL-23能夠刺激CD4+細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，產(chǎn)生IL-17，并刺激基質(zhì)細(xì)胞生成IL-6、IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子，是RA發(fā)病過(guò)程中重要的促炎因子之一，在RA發(fā)病和骨破壞中起到了關(guān)鍵作用[13]。IL-23對(duì)Th17細(xì)胞的維持和擴(kuò)增具有重要意義[14]。IL-23/IL-17軸在炎癥發(fā)生中起重要作用，其免疫通路失調(diào)使自身組織和抗原的免疫耐受遭到破壞，從而導(dǎo)致RA等自身免疫疾病的發(fā)生[15]。

IL-27是一種新的細(xì)胞因子，隸屬IL-12家族，在不同的自身免疫性疾病上可表現(xiàn)出抗炎和促炎雙重作用[16]。IL-27能促進(jìn)分泌IL-10的Treg細(xì)胞分化，抑制Th17細(xì)胞的產(chǎn)生[17]；但也有學(xué)者指出，在缺乏感染編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)時(shí)，IL-27能加速Th17的分化[18]。國(guó)內(nèi)臨床研究發(fā)現(xiàn)， IL-27參與RA的疾病過(guò)程，并將是一個(gè)較好的反映RA活動(dòng)的早期指標(biāo)[19]。Moon等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IL-27通過(guò)調(diào)節(jié)Th17及Treg細(xì)胞平衡，在改善CIA關(guān)節(jié)炎癥狀方面有潛在性的作用。

小柴胡湯由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗組成，具有疏利樞機(jī)、宣達(dá)上下、扶正祛邪的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組踝關(guān)節(jié)腫脹程度均明顯輕于模型組，AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組，其中小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組。提示小柴胡湯能顯著減輕大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，降低AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平。小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。

綜上所述，小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治療RA的作用機(jī)制之一，其治療RA更多的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Xiaochaihutang on IL-17,IL-23,IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis

ZHANG Ying, ZHOU Xiaoli, DAI Min, WU Bin

(Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of Xiaochaihutang on IL-17, IL-23, IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis(CIA)and to explore the possible mechanisms. Methods 40 Wistar rats were divided into nomal group, model group, tripterygium glycosides group, high and low doses of Xiaochaihutang groups. Rheumatoid arthritis model was established in rats in every group except normal group by type Ⅱ collage induction. In 2 weeks after first injection of type Ⅱ collage, tripterygium glycosides group was given tripterygium glycosides 20 mg/(kg·d) by lavage, low and high doses of Xiaochaihutang groups were given 9 g/(kg·d) and 18 g/(kg·d) Xiaochaihutang respectively by lavage, normal group was given the same volume of normal saline. All the groups were treated for 4 weeks. The left-right diameter and anterior-posterior diameter of joint of the rats were measured at one week, two weeks after model establishment, and at one, two, four weeks after lavage. The arthritis index was calculated before lavage, at one, two, four weeks after lavage. Four weeks after the treatment, the expressions of IL-17, IL-23 and IL-27 in serum were detected by ELISA. Results Compared with model group, the swelling of ankle joints and arthritis index of high and low doses of Xiaochaihutang groups reduced significantly (P<0.05). Xiaochaihutang groups and tripterygium glycosides group down-regulated the expressions of IL-23， IL-17 and IL-27 (P<0.05). Xiaochaihutang group was better than that of tripterygium glycosides control group (P<0.05). Conclusion Xiaochaihutang can reduce expressions IL-17, IL-23 and IL-27 in serum of CIA rats, it may be one of its mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

Key words：Xiaochaihutang; collagen-induced arthritis; IL-17; IL-23; IL-27

[收稿日期]2015-12-01

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)13-1391-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.008

[作者簡(jiǎn)介]張瑩，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕病基礎(chǔ)與臨床研究工作。[通信作者]周小莉，E-mail:709885987@qq.com