韓朝永

(江蘇省南京市浦口區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211800)

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膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中miR-140的表達(dá)及其臨床意義

韓朝永

(江蘇省南京市浦口區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211800)

[摘要]目的探討miR-140在膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)患者關(guān)節(jié)液中的表達(dá)及臨床意義。方法選取60例KOA患者和20名健康對(duì)照者作為研究對(duì)象。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)KOA患者和健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平，分析關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平與KOA的相關(guān)性。結(jié)果KOA患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照者(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)患者關(guān)節(jié)液中miR-140水平與Kellgren-Lawrence 分級(jí)有顯著相關(guān)性(r=-0.742,P<0.05)。結(jié)論關(guān)節(jié)液miR-140的表達(dá)水平不僅可以作為KOA的早期診斷標(biāo)志物，也可作為判斷KOA嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]膝骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)液；miR-140

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種常見于中老年人的慢性關(guān)節(jié)疾病，其病理改變主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生。臨床上多表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)受限，嚴(yán)重者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，60歲以上人群KOA患病率約為60%，75歲以上人群則高達(dá)80%，其致殘率可高達(dá)50%以上。不僅給個(gè)人帶來嚴(yán)重的痛苦，也給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[2-3]。因此，如何有效地預(yù)防和治療KOA已成為重大的公共衛(wèi)生學(xué)問題。KOA病因復(fù)雜，多種致病因素和因子均會(huì)導(dǎo)致KOA的發(fā)生和發(fā)展。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA，通過對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控來發(fā)揮其功能[4]。目前的研究證實(shí)miRNA參與調(diào)控一系列重要生理病理過程，包括在免疫炎癥反應(yīng)以及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-140與關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。本研究通過對(duì)膝關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平的測(cè)定，探討其在KOA發(fā)病中的作用，為KOA的診斷和治療提供依據(jù)。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2014年1月—2015年6月在我院接受治療的60例KOA患者和20名健康對(duì)照者作為研究對(duì)象。60例KOA患者中男17例，女43例；年齡53～78(57.74±4.92)歲；病程1～8(3.47±1.52)年。所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)推薦的KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)：①膝關(guān)節(jié)痛在就診的前1個(gè)月內(nèi)≥14 d；②膝關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)有骨磨擦音；③X射線示膝關(guān)節(jié)骨端邊緣有骨刺增生或骨贅形成；④膝關(guān)節(jié)骨性腫脹；⑤膝關(guān)節(jié)晨僵≤30 min；⑥年齡≥40歲。符合上述條件中的①③或①②④⑤⑥即可診斷為KOA。采用Kellgren-Lawrence(K-L)[7]分級(jí)評(píng)估KOA臨床病情：其中Ⅱ級(jí)20例，Ⅲ級(jí)24例，Ⅳ級(jí)16例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有感染性關(guān)節(jié)炎，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷及手術(shù)史，糖尿病患者；②類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的患者；③檢查前2周使用過糖皮質(zhì)激素或非甾體類抗炎藥的患者；④其他反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每位受試者均簽署知情同意書。

1.2關(guān)節(jié)液的收集與保存受試者取平臥位，膝關(guān)節(jié)局部消毒麻醉后，取髕上外側(cè)入路行膝關(guān)節(jié)腔穿刺，抽取關(guān)節(jié)液約2 mL，室溫下靜置1 h。然后3 000 r/min離心20 min去除細(xì)胞和關(guān)節(jié)組織殘存碎片，取上清置于新1.5 mL微量離心管，-80 ℃冰箱保存待后續(xù)檢測(cè)。

1.3miR-140檢測(cè)①總RNA的提取：Trizol法提取關(guān)節(jié)液總RNA。變性瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)法檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。②miRNA逆轉(zhuǎn)錄：制備20 μL RT混合反應(yīng)液：Total RNA 0.3 μg，dNTP (2.5 mM each)2 μL，RT特異引物(1 μM)0.5 μL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(10 IU/μL)2 μL，RNA酶抑制劑(40 IU/μL) 0.3 μL，10×RT Buffer 2 μL。RT反應(yīng)條件：16 ℃，30 min；42 ℃，40 min；85 ℃，5 min；反應(yīng)結(jié)束后，冰上冷卻5 min，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應(yīng)：采用8 μL的反應(yīng)體系：dNTP(2.5 mM each)1.0 μL，10×PCR緩沖液1.0 μL，MgCl2溶液0.6 μL，Taq聚合酶0.5 IU，Sybergreen I至終濃度0.25×，10 μM的PCR特異引物F 0.4 μL，10 μM的PCR特異引物R 0.4 μL，2×ROX Reference Dye 0.2 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。miR-140上游引物5’-GCCTCAGTGGTTTTACCCTA-3’,下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT -3’。

2結(jié)果

2.1KOA患者與健康人關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)比較RT-PCR結(jié)果顯示：健康對(duì)照者關(guān)節(jié)液miR-140相對(duì)表達(dá)水平為1.04±0.29，KOA患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)水平為0.51±0.24，KOA患者明顯低于健康對(duì)照者(P<0.05)，見圖1。

圖1　不同分組患者關(guān)節(jié)液miR-140水平

2.2不同嚴(yán)重程度KOA患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)比較不同K-L分級(jí)患者中，Ⅱ級(jí)患者關(guān)節(jié)液miR-140相對(duì)表達(dá)水平為0.69±0.30，Ⅲ級(jí)患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)為0.51±0.24，Ⅳ級(jí)患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)為0.36±0.21；K-LⅣ級(jí)患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)明顯高于Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)患者(P<0.05)，見圖1。

2.3KOA患者關(guān)節(jié)液miR-140表達(dá)與K-L分級(jí)的相關(guān)性Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示：miR-140在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)水平與KOA的K-L分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.742,P<0.05)，見圖2。

圖2　關(guān)節(jié)液miR-140水平與KL分級(jí)的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3討論

KOA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明，可能為關(guān)節(jié)生物力學(xué)性質(zhì)的改變、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、機(jī)體免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子、性激素水平等因素綜合作用所致[8]。隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA與KOA的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。Iliopoulos等[9]對(duì)比檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KOA患者和正常健康者軟骨組織間存在16個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，提示這些miRNAs可以用來區(qū)分KOA細(xì)胞和正常的軟骨細(xì)胞。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，KOA的發(fā)病與軟骨細(xì)胞和基質(zhì)中異?；罨难装Y遞質(zhì)和基質(zhì)降解酶密切相關(guān)。Yamasaki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著骨關(guān)節(jié)炎軟骨退行性病變的加重，軟骨中miR-146a的表達(dá)量逐漸減少，而基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)則呈平行上升趨勢(shì)。特別是經(jīng)IL-1β體外刺激可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞miR-146a表達(dá)明顯升高。提示miR-146a可能通過調(diào)控IL-1β和MMP-13來參與調(diào)控KOA的發(fā)病。由于miRNA與靶基因的mRNA的3’-UTR不完全互補(bǔ)結(jié)合，因此miRNA具有調(diào)控多個(gè)靶基因的能力。因此miRNA在KOA發(fā)病機(jī)制中起的重要作用也逐步受到學(xué)者們的認(rèn)可和重視。

miR-140為軟骨細(xì)胞中特異性高表達(dá)的miRNA，不僅參與調(diào)控人類軟骨形成和發(fā)育，同時(shí)在維持軟骨細(xì)胞平衡方面起著重要作用[11]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR-140可導(dǎo)致的小鼠軟骨內(nèi)成骨的生長缺陷，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。尤為重要的是小鼠出現(xiàn)了與骨性關(guān)節(jié)炎的病理改變，而轉(zhuǎn)基因過表達(dá)miR-140則可以抵制抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其可能機(jī)制在于miR-140能直接抑制Adamts-5這一導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的重要水解酶的表達(dá)。而骨關(guān)節(jié)炎病程中由于某種因素導(dǎo)致miR-140表達(dá)失調(diào)引起Adamts-5正常調(diào)控機(jī)制的失衡，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

隨著高靈敏性基因芯片和PCR技術(shù)的使用，目前在人體液(如血液、關(guān)節(jié)液、腹腔液、精液等)中能夠檢測(cè)到穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs，且其表達(dá)譜和表達(dá)水平的異常改變與多種疾病病變情況密切相關(guān)。目前已經(jīng)證實(shí)KOA患者關(guān)節(jié)液中相關(guān)細(xì)胞因子和蛋白酶表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，且這種改變與軟骨損傷程度和疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。本研究采用RT-PCR檢測(cè)KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)改變情況。結(jié)果顯示：KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平明顯低于健康人，提示關(guān)節(jié)液miR-140的低表達(dá)不僅可以作為早期診斷KOA的生化指標(biāo)，且miR-140的缺失可能是導(dǎo)致KOA發(fā)生發(fā)展的重要因素，這與相關(guān)報(bào)道是一致的[14]。由于關(guān)節(jié)液由關(guān)節(jié)面滑膜分泌產(chǎn)生，因此，根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為關(guān)節(jié)液中的miR-140主要來源于關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織的分泌和滲透[15]。由于KOA患者關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織的miR-140表達(dá)明顯降低，因而導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平也相應(yīng)降低。進(jìn)一步采用Kellgren-Lawrence對(duì)60例KOA患者嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果顯示：隨著骨關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展，KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)也依次降低。即KOA患者關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。這表明關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)水平還可以作為評(píng)價(jià)膝骨關(guān)節(jié)炎影像和病變嚴(yán)重進(jìn)展的生化指標(biāo)。

總之，本次研究結(jié)果結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，證明miR-140與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。深入研究miR-140不僅有助于進(jìn)一步闡明KOA的發(fā)病機(jī)制，關(guān)節(jié)液miR-140的表達(dá)也可以為KOA的診斷和病情評(píng)估提供重要參考依據(jù)。此外，通過將miR-140作為KOA干預(yù)治療的靶點(diǎn)，從基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上為KOA的治療提供一種新的手段。

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[收稿日期]2015-12-31

[中圖分類號(hào)]R593.21

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)13-1422-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.018