姜衛(wèi)星

(冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200)

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生姜醇提取物對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響

姜衛(wèi)星

(冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200)

[摘要]目的觀察生姜醇提取物對(duì)肝臟缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡的影響。方法將84只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4 mg/kg預(yù)處理組，每組14只。自術(shù)前2周開始，各給藥組均灌胃給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手術(shù)組外，其余組均通過(guò)夾閉肝門靜脈和肝動(dòng)脈的方法制備肝臟缺血再灌注模型，再灌注2 h后，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平及炎癥因子C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10水平， HE染色觀察肝臟組織病理性形態(tài)，TUNEL染色觀察肝細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)，檢測(cè)肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，Western blot法檢測(cè)肝組織中NF-κB蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果與模型組比較，生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組大鼠血清ALT、AST、ALP及CRP、TNF-α、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05)，其中400 mg/kg預(yù)處理組IL-1β水平顯著降低而IL-10水平顯著升高(P均<0.05)。生姜醇提取物各預(yù)處理組大鼠肝臟組織病變和肝細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度改善，其中以400 mg/kg預(yù)處理組效果最為顯著；肝臟組織中SOD、CAT活性顯著升高而MDA含量顯著降低(P均<0.05)，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)和NF-κB蛋白表達(dá)量均顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論生姜醇提取物對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注后細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)具有抑制作用；作用機(jī)制可能與生姜醇提取物能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]生姜醇提取物；肝臟；缺血再灌注；炎癥；凋亡

肝臟手術(shù)過(guò)程中經(jīng)常需要暫時(shí)阻斷血流以減少出血，但恢復(fù)血流再灌注后往往引發(fā)肝臟組織的進(jìn)一步損傷[1]，即缺血再灌注損傷。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)[2]，為臨床上防治缺血再灌注損傷提供了新的思路。生姜性味辛溫，具有解表散寒、溫中止嘔、行水解毒之功效，為我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，生姜具有抗凋亡和抑制炎癥反應(yīng)的生物學(xué)活性[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用夾閉肝門靜脈和肝動(dòng)脈后松夾的方法成功制備肝臟缺血再灌注大鼠模型，研究了生姜醇提取物對(duì)肝臟缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠84只，體質(zhì)量220～260 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥物與試劑生姜醇提取物(陜西旭煌植物科技有限公司，批號(hào)：140728，純度≥90%)；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)密理博公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；TUNEL染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；NF-kB單克隆抗體購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器UV1800 紫外可見光分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；BS200生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；WD-2102A型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司)；CUT4062型石蠟切片機(jī)(德國(guó)SLEE公司)；DYY-11 型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組與模型制備將84只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4 mg/kg預(yù)處理組，每組14只。自術(shù)前2周開始，生姜醇提取物100 ng/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組及金鈉多4 mg/kg預(yù)處理組均灌胃給予相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均每天1次。末次灌胃后第2天，除假手術(shù)組外，其余組均通過(guò)夾閉肝門靜脈和肝動(dòng)脈的方法[4]制備肝臟缺血再灌注模型，假手術(shù)組行手術(shù)通路，但不阻斷肝門靜脈和肝動(dòng)脈。缺血1 h再灌注2 h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，并取肝臟組織標(biāo)本，-20 ℃保存待測(cè)。

1.4.2血清ALT、AST、ALP水平檢測(cè)各組大鼠取血液標(biāo)本，經(jīng)2 000 r/min離心5 min后取上層血清，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平。

1.4.3血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平測(cè)定取血液標(biāo)本，置于冰上緩慢解凍后，根據(jù)ELISA試劑盒操作說(shuō)明，通過(guò)全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

1.4.4肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察取肝臟組織標(biāo)本，置于4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定，經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度約5 μm)和展片處理后，行常規(guī)HE染色，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4.5肝細(xì)胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù)的計(jì)算取1.4.4步驟制備的肝臟組織石蠟切片，進(jìn)行TUNEL染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞凋亡狀況(黃褐色細(xì)胞為陽(yáng)性著色細(xì)胞)。每張染色切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)，各組分別取平均值，然后計(jì)算肝細(xì)胞凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.6肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量檢測(cè)每組隨機(jī)取7只大鼠的肝臟組織，研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟測(cè)定各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.7肝臟組織NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)及半定量分析取1.4.6步驟每組剩余大鼠的肝組織勻漿上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，變性后上樣、電泳，待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃過(guò)夜；洗膜，二抗室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平比較模型組大鼠血清ALT、AST、ALP水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4 mg/kg預(yù)處理組血清ALT、AST、ALP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比較模型組大鼠血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)， IL-10水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組血清CRP、TNF-α、IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中400 mg/kg預(yù)處理組IL-1β水平明顯低于模型組(P<0.05)，IL-10水平明顯高于模型組(P<0.05)。見表2。

表1　各組大鼠血清ALT、AST、ALP水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞形態(tài)均未見異常；模型組大鼠肝組織紋理不清，肝竇充血，部分肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝細(xì)胞呈空泡變性和壞死，胞核固縮并深染；而各給藥組肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變明顯改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg預(yù)處理組效果最為顯著。見圖1～6。

表2　各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1　假手術(shù)組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

圖2　模型組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.4各組大鼠肝臟組織TUNEL染色表現(xiàn)模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多；而各給藥組大鼠肝細(xì)胞凋亡狀況明顯改善，其中以生姜醇提取物400 mg/kg預(yù)處理組效果最為顯著，見圖7～12。假手術(shù)組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)為(2.6±1.4)%，模型組為(37.5±6.9)%，生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組分別為(30.2±7.0)%、(24.1±5.4)%、(14.7±4.2)%，金納多4 mg/kg預(yù)處理組為(26.9±5.5)%。模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4 mg/kg預(yù)處理組均明顯低于模型組(P均<0.05)。

圖4　生姜醇提取物200 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝臟

圖5　生姜醇提取物400 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝臟

圖6　金納多4 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

圖7　假手術(shù)組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

圖8　模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

圖9　生姜醇提取物100 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

圖10　生姜醇提取物200 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

圖11　生姜醇提取物400 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

圖12　金納多4 mg/kg預(yù)處理組大鼠肝細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

2.5各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較模型組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，MDA含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；生姜醇提取物200mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組SOD、CAT活性均明顯高于模型組(P均<0.05)，MDA含量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

2.6各組大鼠肝臟組織NF-κB蛋白表達(dá)量比較假手術(shù)組、模型組、生姜醇提取物100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4mg/kg預(yù)處理組肝臟組織NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.15±0.04，0.42±0.13，0.37±0.12，0.32±0.09，0.26±0.08，0.30±0.10。模型組大鼠肝臟組織中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而生姜醇提取物200 mg/kg、400 mg/kg預(yù)處理組和金納多4 mg/kg預(yù)處理組的NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。各組大鼠肝臟組織中NF-κB蛋白表達(dá)量電泳圖見圖13。

表3　各組大鼠肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較±s)

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為生姜醇提取物100 mg/kg預(yù)處理組；

3討論

肝臟缺血再灌注損傷是影響肝臟手術(shù)預(yù)后、損傷肝功能的危險(xiǎn)因素之一。近年來(lái)，隨著病理生理機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)及其繼發(fā)的細(xì)胞凋亡是其重要的發(fā)病原因之一。華晨等[5]和齊艷艷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、改善肝細(xì)胞凋亡能夠有效緩解肝臟缺血再灌注損傷。

肝臟組織中脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量能夠間接反映肝細(xì)胞膜受氧化應(yīng)激損傷程度[7]； SOD能夠提供氫原子配體而催化還原氧自由基生成過(guò)氧化氫[8-9]，并在CAT的作用下進(jìn)一步還原生成對(duì)人體無(wú)害的水和氧[10]，因此SOD和CAT的活性能夠反映機(jī)體抗氧化能力水平。血清中ALT、AST和ALP水平是反映肝功能及肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，正常情況下，血液中ALT、AST含量都非常低，當(dāng)細(xì)胞膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊而受損時(shí)，它們將迅速釋放入血，使血清中含量陡然增高，因此血清中三者的水平能夠非常敏感地反映肝臟組織受損傷程度，而血清中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平是臨床上用來(lái)監(jiān)測(cè)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)。

細(xì)胞凋亡是一種有多種基因參與調(diào)控的程序化死亡過(guò)程，可由多種因素導(dǎo)致其發(fā)生，其中氧化應(yīng)激損傷是其重要的誘發(fā)因素[11]。NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子，常態(tài)下，NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中；而當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，NF-κB將暴露出核定位信號(hào)并進(jìn)入胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB激活能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，證實(shí)NF-κB激活與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

生姜為姜科植物姜的新鮮根莖，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其提取物具有良好的抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)生姜醇提取物能夠有效降低血清中炎癥因子水平，改善抗氧化酶活性，抑制氧化應(yīng)激損傷，改善肝臟組織病變，降低NF-κB蛋白表達(dá)水平，抑制肝細(xì)胞凋亡，提示生姜醇提取物對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷后肝臟細(xì)胞亡凋和炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

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Effect of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

JIANG Weixing

(Jizhong Energy Fengfeng Group Hospital, Handan 056200, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of ethanol extract of zingiber officinale against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 84 SD rats were randomly divided into five groups: sham operation group, ischemia-reperfusion control group, ethanol extract of zingiber officinale (100, 200, 400 mg/kg) dose per-treated groups and Ginaton 4 mg/kg per-treated group, 14 cases in each group. Two weeks before operation, the animals were treated with corresponding drug or normal saline by intragastric administration, once a day. Second days after the last irrigation stomach, except the sham operation group, the hepatic ischemia reperfusion models in the other groups were made by occlusion of hepatic portal vein and hepatic artery. Two hours after reperfusion, the content of ALT, AST, ALP, CRP, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 in plasma were detected, the histopathological changes were observed by HE staining, the activity of SOD, CAT and the content of MDA were determined; the hepatocyte apoptosis were observed by TUNEL staining, and the apoptosis (AI) was calculated; the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and semi-quantitative analysis. Results Compared with the ischemia-reperfusion control group, the contents of CRP, TNF-α, IL-6 in plasma of ethanol extract of zingiber officinale 200, 400 mg/kg dose per-treated groups were significantly decreased (all P<0.05); the content of IL-1β was significantly decreased and the content of IL-10 was significantly increased in ethanol extract of zingiber officinale 100 mg/kg dose per-treated group (all P<0.05). The activity of SOD, CAT were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased in ethanol extract of zingiber officinale per-treated groups, the histopathological changes and the hepatocyte apoptosis were significantly improved, the AI and the expression of NF-κB proten were significantly down-regulated (all P<0.05). Conclusion The ethanol extract of zingiber officinale has inhibition effects against inflammation and hepatocyte apoptosis after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats; which perhaps relate to its effects of improve the activity of antioxidase, and reduce the damage of free radical, and down-regulate the expression of NF-κB proten.

Key words:ethanol extract of zingiber officinale; liver; ischemia-reperfusion; inflammation; apoptosis

[收稿日期]2015-10-30

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)09-0932-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.007

[作者簡(jiǎn)介]姜衛(wèi)星，男，主治醫(yī)師，從事普通外科臨床研究工作。