楊　帆,陳　琳,劉鐵梅,焦立新△,韓　瑜△,于江虹,陳俊宇,趙本正

(1.長春市中心血站，吉林 長春130033；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

?

△共同通訊作者

血小板輸注無效患者血小板特異性糖蛋白抗體表達的實驗研究

楊帆1,陳琳1,劉鐵梅2,焦立新1△,韓瑜1△,于江虹1,陳俊宇2,趙本正2

(1.長春市中心血站，吉林 長春130033；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

摘要：目的探討血小板輸注無效(PTR)患者血小板特異性糖蛋白抗體的表達情況。方法采用ELISA方法檢測56名臨床上確診為PTR患者的血小板特異性糖蛋白抗體、應用PCR方法檢測其血小板特異性抗原(HPA)1-6，15 基因分型。結(jié)果56名PTR患者檢出血小板特異性糖蛋白抗體，8例表達陽性(占14.3%)，包括血小板特異性糖蛋白 GPⅡb/Ⅲa 陽性7例，GPⅠa/Ⅱa陽性1例、GPⅠb/Ⅰx陽性1例、GPⅣ陽性1例。結(jié)合8例患者的抗體檢測反應格局和HPA抗原基因型結(jié)果分析抗體的特異性為：4例存在抗-HPA3b、3例存在抗-HPA3a、1例存在抗-HPA5b。結(jié)論反復輸血的血小板輸注無效患者，應選擇HPA抗原相匹配的血小板供者，以改善血小板輸注效果。

關鍵詞：血小板；HPA；血小板特異性糖蛋白抗體；血小板輸注無效

(ChinJLabDiagn,2016,20:0620)

血小板輸注無效(PTR) 是指患者經(jīng)過2次或以上ABO血型相配的血小板輸注后，血小板計數(shù)與輸注前相比，沒有達到合適的糾正計數(shù)增加率，甚至較輸血前下降的現(xiàn)象。引起 PTR 的主要原因：一是同種免疫因素(HLA抗體、血小板特異性糖蛋白相關HPA抗體及紅細胞相關抗體)；二是非免疫因素，包括發(fā)熱、感染、脾腫大等。一般認為由于同種免疫產(chǎn)生抗體是臨床血小板輸注無效的主要因素[1]。目前對HLA抗體較為重視，但少部分患者血小板輸注效果仍舊不能改善。因此，我們對血小板輸注無效患者的血小板特異性糖蛋白抗體表達情況進行分析，該實驗研究包括患者的HPA抗原系統(tǒng)HPA1-6,15基因分型和血小板特異性糖蛋白抗體的ELISA法檢測，進而分析抗體特性?，F(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1研究對象選取 2015年1月-10月因血小板輸注無效來我血液中心做血小板配型的患者，共56名(包括男性29名、女性27名)，平均年齡45歲，分別為白血病28例、再生障礙性貧血25 例、骨髓增生異常綜合征(MDS)3 例。這些患者輸注血小板均2次以上，輸注后血小板不升高甚至下降，符合PTR的臨床診斷。抽取靜脈血5 ml/人，分別置于EDTA抗凝管和干燥試管中，4℃保存。

1.2試劑與儀器PAK-PlUS抗體檢測試劑盒(批號：3002286，美國GTI公司)；HPA1-6,15 基因檢測試劑盒(批號：201403004，天津秀鵬公司)；DNA提取試劑盒(Lot N2905，德國 QIAGEN公司)；PCR 儀(C1000 Touch型，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析儀(UVP，JY04S-3C，北京六一儀器)；超微量微孔板分光光度計(Epoch，美國 Bio-Tek 公司)。

1.3PCR法HPA1-6,15基因分型從EDTA抗凝試管中取標本全血500 μl/份，提取DNA，濃度(50-100)ng/μl、純度1.6-1.8；PCR擴增按照試劑盒說明書操作，配制 Buffer-酶-樣本混合液，分別加入每個引物孔，上PCR儀擴增，經(jīng)變性、退火、延伸，模板DNA與特異性引物結(jié)合、擴增，取擴增產(chǎn)物10 μl在2% 瓊脂糖凝膠中(含溴化乙錠1 μg/μl)電泳20 min，凝膠成像分析儀觀察結(jié)果并拍照。

1.4ELISA法檢測血小板特異性糖蛋白抗體使用PAK-PlUS ELISA試劑盒檢測56名PTR患者，按照說明書操作，加入終止液后用分光光度計在405 nm處讀取各孔吸光度，490 nm為參照波長，測定孔吸光度≥2倍陰性孔(cut-off值)即判為陽性結(jié)果。反應板A、B孔為血小板特異性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，分別包被了 HPA-1a/1a、3a/3a、-4a/和HPA-1b/1b、3b/3b、-4a；C、D孔為血小板特異性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa，分別包被了 HPA-5b/5b、 HPA-5a/5a;E孔為血小板特異性糖蛋白GPⅠb/Ⅰx；F孔為血小板特異性糖蛋白GPⅣ。結(jié)合血小板特異性糖蛋白和HPA基因分型結(jié)果，可以推斷HPA抗體的特異性。

2結(jié)果

2.1患者HPA1-6,15基因分型結(jié)果患者HPA基因型為HPA-1aa，2aa，3bb，4aa，5aa，6aa，15ab(見圖1)。

注：1-14依次為1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a、6b、15a、15b;M為Marker

圖1患者HPA基因分型電泳圖

2.2血小板特異性糖蛋白抗體檢測結(jié)果被檢測的56例PTR患者中共8例(占14.3%)有血小板特異性糖蛋白抗體表達，其中抗GPⅡb/Ⅲa 7例、抗GPⅠa/Ⅱa 陽性1例、抗GPⅠb/Ⅰx陽性1例，抗GPⅣ陽性1例。對這8例抗體檢測陽性的患者反應格局和HPA抗原基因分型結(jié)果進行分析，進而推斷患者體內(nèi)表達的血小板特異性糖蛋白抗體特性，檢出4例抗-HPA3b、3例抗-HPA3a、1例抗-HPA5b(具體見表1)。

表1　 8名患者表達的血小板特異性糖蛋白抗體及特性

3討論

血小板特異性糖蛋白抗體的產(chǎn)生與血小板表面的特異性抗原密切相關，特異性抗原均存在于血小板膜糖蛋白上(GP)，由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)血小板獨特的遺傳多態(tài)性，是由單一核苷酸改變或一對堿基置換引起個別氨基酸的不同形成的(例如HPA-3a、3b是糖蛋白GPⅡb 的常見多態(tài)性，是由第843位氨基酸多態(tài)性引起)。反復多次輸注血小板可使GP抗原刺激受血者產(chǎn)生同種免疫性抗體，這是免疫性PTR產(chǎn)生的重要原因。血小板輸注量和輸注次數(shù)越多，患者體內(nèi)免疫相關性血小板抗體的產(chǎn)生概率越高，也越容易導致PTR[2]。

我們對抗體檢測陽性的患者反應格局和HPA抗原基因分型結(jié)果進行分析，推斷出患者體內(nèi)表達的抗體特性。例如：患者1檢測GPⅡb /Ⅲa (+)，HPA 抗原HPA1-6,15均為aa 純合子，則存在抗-HPA-1b、-3b，但HPA-1b 在本地區(qū)不是高頻抗原[3]，推斷表達抗-HPA3b，選擇血小板供者HPA-3aa;患者2的GPⅠa/Ⅱa(+)，且HPA抗原為HPA-5aa，可推斷該患者存在抗-HPA5b，選用HPA-5aa 的供者;患者5和7除檢測到常見的GPⅡb /Ⅲa外，還分別檢出了-GPⅠb/Ⅰx和GPⅣ，因此在供者選擇上要求更高，應盡量選擇HPA抗原基因型相同的患者(表1)。

不同人群中的HPA抗原的分布頻率與獲得HPA免疫機會正相關，即HPA抗原a/b對偶不配合的比例越高，產(chǎn)生抗體幾率越高[4]，白人中抗HPA-1a抗體最常見，日本人中抗HPA-2b最常見。我們以往的研究數(shù)據(jù)表明[3]：中國北方地區(qū)人群HPA-1-5和15的6個a/b對偶抗原不配合率中HPA-3(0.366)及HPA-15(0.374)系統(tǒng)不配合率最高，其他系統(tǒng)不配合率較低。本實驗檢出HPA抗體以抗-HPA 3b、3a最多，與HPA-3抗原系統(tǒng)的不配合率相符；但是由于目前檢測試劑還不能精確分辨出血小板特異性糖蛋白抗體的所有特異性，因此抗-HPA 15a、15b在患者體內(nèi)的表達情況還有待今后繼續(xù)探討。

通過血小板特異性糖蛋白抗體檢測，可在供者選擇中盡量避免相對應抗原，減輕免疫性因素對血小板輸注效果的影響。本實驗研究顯示有14.3%的血小板輸注無效患者血清中檢測到有血小板特異性糖蛋白抗體表達，說明除HLA抗體外，HPA抗原和抗體也是臨床輸血中值得重視的一項免疫因素，避免輸注HPA抗原不匹配的血小板，可以減少血小板輸注無效的發(fā)生，減少血液資源的浪費。

參考文獻：

[1]Marwaha N，Shama RR．Consensus and controvercies in platelet transfusion[J]．Transfus Apher Science，2009，41(2):127.

[2]馬印圖，李振奇，王全立．血小板抗體檢測技術(shù)進展[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，11(29):1041.

[3]于江虹,楊帆,焦立新,等.長春地區(qū)無償獻血者HPA1-6,15 基因分型及頻率調(diào)查[J].中國實驗診斷學，2011,15(4)，680.

[4]Kiefel V，Konig C，Kroll H，et al． Platelet alloantibodies in transfused patients[J]．Transfusion，2001，41(6):766.

Experimental study on expression of anti-platelet glycoprotein specific antibody in the platelet transfusion refractoriness patient

YANGFan,CHENLin,LIUTie-mei,etal.

(ChangchunBloodStation,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of anti-platelet glycoprotein specific antibody in the platelet transfusion refractoriness patients.Methods56 platelet transfusion refractoriness patients were studied.platelet-specific glycoprotein antibody were detected with ELISA.HPA1-6，15 genotypes were detected with PCR.Results56 PTR patients in all,anti-platelet glycoprotein specific antibody in 8 cases were positive.Respectively,7 cases were GPⅡb/Ⅲa antibody positive;1 cases were GPⅠa/Ⅱa antibody positive;1 cases were GPⅠb/Ⅰx antibody positive;1 cases were GPⅣ antibody positive.After analyze platelet glycoprotein specific antibody and patients’ HPA genotypes,there are 4 cases anti-HPA3b,4 cases anti-HPA3a and 1 cases anti-HPA5b.ConclusionAbout these platelet repeated transfusion refractoriness patient,the Donor whose HPA antigen match to patient should be chosen to improve the transfusion effect.

Key words:platelet;HPA;platelet-specific glycoprotein antibody;platelet transfusion refractoriness

(收稿日期：2015-12-30)

中圖分類號：R446.62 R331.1+ 43

文獻標識碼：A

基金項目：吉林省自然科學基金項目(201015186)、吉林省衛(wèi)生青年科研課題(2013Q016)、吉林省衛(wèi)生自籌經(jīng)費課題(2013ZC010)

文章編號：1007-4287(2016)04-0620-03