王述琦,劉麗秋,劉海娜

(1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 a干?？?b超聲科,山東 青島266011；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科)

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11β-類固醇脫氫酶-2啟動(dòng)子區(qū)甲基化與原發(fā)性高血壓關(guān)系初探

王述琦1a,劉麗秋2*,劉海娜1b

(1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 a干?？?b超聲科,山東 青島266011；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科)

摘要：目的通過(guò)11β- 類固醇脫氫酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 ,11β-HSD-2)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率的測(cè)定,探討原發(fā)性高血壓可能的發(fā)病機(jī)制。方法選取未經(jīng)治療的原發(fā)性高血壓患者64例以及正常對(duì)照組30例,Sequenom MassArray質(zhì)譜法檢測(cè)11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)“-101到461”的563個(gè)堿基序列的甲基化發(fā)生率。結(jié)果原發(fā)性高血壓組甲基化發(fā)生率高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CpG位點(diǎn)如下：CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65、CpG_72。t值分別為-5.42,-3.17,-2.84,-2.32和-2.32,P<0.05。CpG_7、8、CpG_9位于核心啟動(dòng)子區(qū)。結(jié)論原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化發(fā)生率位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：11β-類固醇脫氫酶-2;原發(fā)性高血壓;啟動(dòng)子區(qū);甲基化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0570)

我國(guó)大約有2億高血壓患者,且發(fā)病率逐年上升[1,2]。近年來(lái)研究[3-6]發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾與高血壓發(fā)病密切相關(guān)。已有研究證實(shí)11β- 類固醇脫氫酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2,11β-HSD-2)[7]參與高血壓的發(fā)病[8,9]。高血壓患者11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率的測(cè)定國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與原發(fā)性高血壓的關(guān)系。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象收集64例未經(jīng)藥物治療的原發(fā)性高血壓(符合JNCVⅡ及歐洲高血壓指南)患者作為觀察組,其中男52例,女12例,平均年齡(46.5±9.4)歲。30例健康查體者作為正常對(duì)照組,其中男24例,女6例,平均年齡(44.4±8.2)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有觀察者均已排除正在使用降壓藥物者、繼發(fā)性高血壓、腎功能不全、肝硬化、甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病、冠心病、心臟瓣膜病、腫瘤、自體免疫病、過(guò)量飲酒及其它慢性疾病。2組患者一般資料及體質(zhì)量指數(shù)具有可比性,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2檢測(cè)項(xiàng)目生化全套、甲功及血、尿常規(guī)、心電圖、胸X線片,測(cè)定11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率測(cè)定。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器DYY-Ⅲ型電泳槽(北京市六一儀器廠),FD201 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京通用分析儀器廠),Tanon-3500 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司),全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)NanoDrop-2000(美國(guó) NanoDrop公司),DNA濃縮儀(Eppendorf,Concentractor5301),K960熱循環(huán)儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司), MassARRAY系統(tǒng)(Sequenom公司),TF-0384型384孔PCR板(ABGene公司), Veriti 384 well PCR儀(AB公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)試劑及耗材PureGene DNA抽提試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO), 樣本亞硫酸鹽處理用試劑盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO),一套 10 μM 擴(kuò)增引物(上海賽百勝基因技術(shù)有限公司合成),25 mM dNTP 混合物(Sequenom 公司),5 U/μL 熱啟動(dòng) Taq 酶(Sequenom 公司),SAP 緩沖液(Sequenom 公司),SAP 酶(1.7 U/μL) (Sequenom 公司),T Cleavage Mix(Sequenom 公司),100 mM DTT(Sequenom 公司),T7 RNA & DNA Polymerase(Sequenom 公司),RNase A(Sequenom 公司),Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ(大連寶生物工程公司),溴酚藍(lán)(上海生工生物工程公司),瓊脂糖(Agarose),(上海生工生物工程公司)。

1.5引物設(shè)計(jì)和合成引物信息：5’端引物序列：aggaagagagGGGAGAGAAGTGAAGGAAAGTT,3’端引物序列 :cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCAATCCTATTAAATATCCAATCCC。查詢并確定待測(cè)的基因序列,將目的序列輸入到EpiDesigner軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。將目的序列粘貼到PasteSequence中,根據(jù)軟件運(yùn)算結(jié)果,選擇并確定合適的引物方案,合成引物,每條50D。由華大基因科技有限公司完成。

1.6外周血DNA的提取抽取高血壓患者和正常對(duì)照組觀察者清晨空腹靜脈血3 ml,按照PureGene DNA抽提試劑盒說(shuō)明書方法提取外周血DNA。

1.7Sequenom MassARRAY甲基化檢測(cè)11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率。由華大基因科技有限公司完成。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)。將甲基化發(fā)生率做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使之成正態(tài)分布,對(duì)每一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)分別做高血壓組和正常對(duì)照組的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

入選94例(原發(fā)性高血壓患者64例,正常觀察者30例),檢測(cè)11β-HSD-2基因啟動(dòng)子區(qū) “-101到461”的一段包含563個(gè)堿基序列的基因片段,其中核心啟動(dòng)子位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)“-52到7”的堿基序列,其中包含CpG_7、8、9三個(gè)甲基化位點(diǎn)。甲基化發(fā)生有顯著性差異的CpG位點(diǎn)如下：CpG_7、8 位于“-20到-14”的位置(t=-5.42,P<0.05)。

CpG_9 位于“-8到-9”的位置(t=-3.17,P<0.05)。CpG_62、63、64位于“373到378”的位置(t=-2.84,P<0.05)。CpG_65位于“390到391”的位置(t=-2.32,P<0.05)。CpG_72位于“430到431”的位置(t=-2.32,P<0.05)。凝膠電泳結(jié)果分別如下圖1。

圖1　凝膠電泳結(jié)果

3討論

近年來(lái)DNA甲基化在心血管領(lǐng)域的研究漸成為焦點(diǎn)并受到學(xué)者們的關(guān)注,甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)下,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一個(gè)甲基集團(tuán),變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學(xué)修飾過(guò)程。DNA 甲基化主要發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)的CpG 島,啟動(dòng)子區(qū)CpG發(fā)生甲基化改變了基因的表觀遺傳性狀,基因的活性發(fā)生了變化,進(jìn)而影響細(xì)胞分化、基因調(diào)控、X 染色體失活等諸多過(guò)程[5,6]。甲基化與高血壓發(fā)病相關(guān)[10,11],因此了解DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制對(duì)于原發(fā)性高血壓的預(yù)防、控制和臨床合理用藥具有重要意義。

近年來(lái)研究證據(jù)顯示,代謝酶11β-HSD-2活性降低,游離皮質(zhì)醇水平升高可導(dǎo)致高血壓[12]。11β-HSD-2基因通過(guò)發(fā)生甲基化調(diào)控,影響11β-HSD-2的表達(dá)和活性,從而通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活,以及腎性水鈉潴留等途徑引起高血壓的發(fā)生[13]。

國(guó)外Alikhani-Koopaei 等[14]的研究證實(shí),11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子及第一外顯子區(qū)的CpG 島發(fā)生甲基化會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性下降,引起11β-HSD-2 表達(dá)降低,進(jìn)而使血壓升高。體外培養(yǎng)人類細(xì)胞和對(duì)大鼠進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),給予DNA 甲基化酶抑制劑5- 氮雜胞苷及普魯卡因胺后,11β-HSD-2基因轉(zhuǎn)錄水平提高,進(jìn)而表達(dá)增加,提示成年個(gè)體DNA 甲基化水平的改變與高血壓的發(fā)病密切相關(guān)。Friso 等[15]對(duì)原發(fā)性高血壓患者和部分繼發(fā)性高血壓患者的研究,發(fā)現(xiàn)人外周血單核細(xì)胞上的11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度增高,11β-HSD-2 基因表達(dá)下降,血壓升高,提示11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與血壓水平呈正相關(guān)。Wyrwoll 等[16]對(duì)孕婦的研究發(fā)現(xiàn),孕婦服用地塞米松會(huì)降低子代腎臟11β-HSD-2 的表達(dá),導(dǎo)致血壓升高。Burns 等[17]對(duì)這種機(jī)制的研究認(rèn)為,子代胚胎植入子宮的過(guò)程中絕大多數(shù)基因會(huì)發(fā)生去甲基化反應(yīng),而由于母體子宮內(nèi)環(huán)境不同引起去甲基化水平的差異,導(dǎo)致基因表達(dá)的差異。以上研究證實(shí),11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的發(fā)生與高血壓發(fā)病密切相關(guān)。

總之研究認(rèn)為,高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度增高致11β-HSD-2基因表達(dá)下降,11β-HSD-2酶活性降低,進(jìn)而血壓升高。11β-HSD-2酶活性與高血壓的關(guān)系國(guó)內(nèi)研究[18-20]較為一致的觀點(diǎn)是11β-HSD-2酶活性下降,血壓升高。但高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。

本研究共篩選未治療的原發(fā)性高血壓患者64例,正常對(duì)照組30例,共檢測(cè)11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)-101至461區(qū)域內(nèi)563個(gè)核苷酸序列的甲基化位點(diǎn)27個(gè),其中甲基化發(fā)生率明顯高于正常對(duì)照組的位點(diǎn)是CpG_7、8(位于-20到-14)、CpG_9(位于-8到-9)、CpG_62、63、64(位于373-378)、CpG_65(位于390到391)和CpG_72(位于430到431),其中CpG_7、8、9位點(diǎn)位于核心啟動(dòng)子區(qū)。Sequenom MassArray時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)用于甲基化定量分析研究,是目前唯一采用質(zhì)譜法進(jìn)行直接檢測(cè)的設(shè)備。質(zhì)譜法甲基化檢測(cè)具有很高的靈敏度和穩(wěn)定性,可定量分析DNA甲基化發(fā)生率,尤其適合臨床上容易獲取、但DNA含量低的血漿標(biāo)本。關(guān)于原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道,采用質(zhì)譜法甲基化檢測(cè),初步證實(shí)原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的高甲基化CpG位點(diǎn),包括位于核心啟動(dòng)區(qū)的CpG_7、8、CpG_9以及位于啟動(dòng)子區(qū)的CpG_62、63、64、CpG_65和CpG_72。由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)不足、時(shí)間、經(jīng)費(fèi)限制本研究例數(shù)相對(duì)較少。原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量觀察。另外可進(jìn)一步觀察11β-HSD-2 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率與腎素-血管緊張素-醛固酮的相關(guān)性,從而更進(jìn)一步闡明11β-HSD-2基因甲基化參與高血壓發(fā)病的機(jī)制。

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Methylation rate detection of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in primary hypertension patients

WANGShu-qi,LIULi-qiu,LIUHai-na.

(Departmentofspecialhealthcare,QingdaoUniversityAffiliatedQingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveBy detecting the methylation rate of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in patients suffering from primary hypertension,to investigate the mechanism of primary hypertension.MethodsTo select 64 cases of untreated patients suffering from primary hypertension and 30 healthy persons as controls.The CpG islands of 11β-HSD-2 gene promoter include 563 bases from “-101 to 461”.To detect its methylation rate using Sequenom MassArray method.ResultsThe methylation rates are higher at CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65 and CpG_72 in patients suffering from primary hypertension,and the differences are significant,t=-5.42,-3.17,-2.84,-2.32 and -2.32,P<0.05.CpG_7、8 and CpG_9 are in the core promoter sequence.ConclusionPatients suffering from primary hypertension have hypermethylation frequency sites in the promoter region of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 gene as compared to the control group.

Key words:11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2；Primary hypertension；Promoter；Methylation

(收稿日期：2015-10-16)

中圖分類號(hào)：R541.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)04-0570-04