曹　拓，趙春娟，余振東

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科；b.生物治療室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.深圳市沙井人民醫(yī)院)

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miR-122在腎癌中的異常表達(dá)及其臨床意義

曹拓1a，2，趙春娟3，余振東1b*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科；b.生物治療室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.深圳市沙井人民醫(yī)院)

摘要：目的探討腎癌中miR-122的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。方法基于前期平行測序的工作基礎(chǔ)，對51例腎癌及相應(yīng)癌旁組織、15例腎癌患者血清及15例健康對照者血清中miR-122的表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR檢測，分析miR-122的表達(dá)高低與腎癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性；并通過在腎癌細(xì)胞系(786-O和ACHN)中轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitors，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖改變，初步探討miR-122的生物學(xué)功能。結(jié)果相對于癌旁組織，腎癌組織中miR-122表達(dá)水平明顯升高，上調(diào)率為82.35%；相比于健康對照者血清，腎癌患者血清中的miR-122表達(dá)亦明顯升高，上調(diào)率為100%。腎癌組織中miR-122的表達(dá)水平與腎癌患者的臨床病理特征無顯著相關(guān)性(P>0.05)。在腎癌細(xì)胞系(786-O和ACHN)中轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitors后，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。結(jié)論miR-122可能參與到腎癌的病理過程，研究腎癌中miR-122的表達(dá)特點(diǎn)及生物學(xué)功能可能對早期診斷及治療腎癌具有潛在的臨床價(jià)值。

關(guān)鍵詞：微小RNA；miR-122；腎細(xì)胞癌

(ChinJLabDiagn,2016,20:0559)

腎細(xì)胞癌(簡稱腎癌)是人群中最常見的十大惡性腫瘤之一[1]。在全球范圍內(nèi)，每年有超過270000例的新發(fā)腎癌病例被診斷出來，并導(dǎo)致每年發(fā)生110000死亡病例數(shù)[2]。盡管腎癌的致死率逐漸趨于平緩，但是腎癌的發(fā)生率仍在逐漸上升[2]。因此，本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測腎癌組織及腎癌病人血清中miR-122的表達(dá)情況，探討其表達(dá)高低與患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)性；并通過在腎癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitor的方法，來初步探究miR-122在腎癌中的生物學(xué)功能，為后續(xù)深入的功能及機(jī)制研究探索奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1組織和血清樣本51例腎癌及配對的癌旁組織樣本收集于北京大學(xué)深圳醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，組織標(biāo)本剪碎后浸泡于RNAlater(Qiagen)中保存，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?5例腎癌患者血清樣本及作對照用的15例健康者血清樣本均從北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科收集，血清樣本分裝于1.5 ml離心管后于-80℃凍存?zhèn)溆?。所有腎癌組織樣本取自于術(shù)前未經(jīng)過任何形式的抗腫瘤治療的患者，并且所獲取組織樣本全部經(jīng)過經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師確診。腎癌標(biāo)本的臨床病理分期采用WHO腎癌分型標(biāo)準(zhǔn)和美國癌癥聯(lián)合會(huì)分期系統(tǒng)作為參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)樣本(組織和血清)的獲取及使用均獲得患者知情同意，并通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑材料用于組織和血清中miRNAs提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量的試劑(miRNeasy Mini Kit、miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript Reverse Transcription Kit和miScript SYBR Green PCR Kit)均為Qiagen公司(德國)產(chǎn)品。miR-122熒光定量反應(yīng)中上游特異性引物為5’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3’，由Invitrogen 公司(美國)合成，其下游引物為試劑盒中提供的通用引物(詳見miScript Reverse Transcription Kit說明書)。以U6為內(nèi)參基因，作熒光定量檢測的參比，特異性引物的上游及下游序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，均由Invitrogen 公司(美國)合成。MTT試劑購自Sigma公司(美國)。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國)。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)均為Gibco公司(美國)的產(chǎn)品。

1.1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系A(chǔ)CHN和786-O細(xì)胞購自ATCC(美國)。

1.2方法

1.2.1組織及血清miRNAs提取分別采用miRNeasy Mini Kit、miRNeasy Serum/Plasma Kit提取組織和血清中的miRNAs。按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2miRNAs逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測參考miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒說明書進(jìn)行操作。參照miScript SYBR Green PCR Kit說明書進(jìn)行熒光定量反應(yīng)的體系設(shè)置。血清以及組織樣本的熒光定量檢測分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。腎癌患者血清樣本、腎癌組織樣本中miRNAs表達(dá)量定義為實(shí)驗(yàn)組(c)，健康志愿者血清樣本及癌旁相應(yīng)正常組織中miRNAs表達(dá)量定義為對照組(n)。miR-122作為檢測目的基因，以U6的表達(dá)水平作為內(nèi)參對熒光定量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。當(dāng)定量PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)，所經(jīng)過的循環(huán)反應(yīng)數(shù)以CT值表示。ΔCTc=CTc目的-CTc內(nèi)參，ΔCTn=CTn目的-CTn內(nèi)參；公式中CTc目的代表腎癌或腎癌患者血清樣本中miR-122的CT值，CTn目的代表癌旁正常組織或健康對照者血清樣本中miR-122的CT值，CTc內(nèi)參代表腎癌組織或腎癌患者血清樣本中內(nèi)參基因U6的CT值，CTn內(nèi)參代表癌旁正常組織或健康對照者血清樣本中內(nèi)參基因U6的CT值。miR-122相對于對照組的表達(dá)水平(Re)采用ΔΔCT的方法進(jìn)行分析處理:Re=2-ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCTc-ΔCTn。依據(jù)miR-122的表達(dá)(log2Re)狀況，將51例腎癌組織樣本分為高表達(dá)組與低表達(dá)組；以log2Re等于2為界限， 大于或等于2的樣本劃為高表達(dá)組，小于2的樣本劃為低表達(dá)組。

1.2.3組織和血清樣本RT-qPCR產(chǎn)物凝膠電泳將熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與Loading buffer(6x)以5：1的比例均勻混合，在1%瓊脂糖凝膠的中進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳條帶的亮度來驗(yàn)證RT-qPCR數(shù)據(jù)的可靠性。

1.2.4腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖的檢測轉(zhuǎn)染分三組進(jìn)行：(1)inhibitor組，即加入合成的miR-122 inhibitors和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體；(2)inhibitor control組，即加入對照序列和脂質(zhì)體；(3)mock組，僅加入脂質(zhì)體。首先，將約6×103個(gè)細(xì)胞(ACHN和786-O細(xì)胞)接種于96孔板，24 h后將經(jīng)opti-MEM稀釋后的miR-122 inhibitors和對照序列(濃度均為50 nm/L)加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，空白組僅加入脂質(zhì)體。在轉(zhuǎn)染0 h，24 h，48 h，72 h后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)于37℃溫箱中孵育培養(yǎng)4 h。最后，小心移除培養(yǎng)孔中的液體，在每孔中加入150 μl DMSO，震蕩混勻，直到無可見沉淀存在，以490 nm為檢測波長、以630 nm為參考波長，在酶標(biāo)儀上測定每孔的吸光值(OD值)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。腎癌及相應(yīng)癌旁組織、腎癌患者血清及配對健康對照者血清中的miR-122的表達(dá)水平的差異采用配對樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析；細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中三個(gè)分組之間在同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量(OD值)的差異采用方差分析來進(jìn)行評估；腎癌組織中miR-122的相對表達(dá)水平與腎癌患者臨床病理特征間的關(guān)系采用四格表卡方檢驗(yàn)和R×C表Fisher的精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)為P值小于0.05。

2結(jié)果

2.1miR-122在腎癌組織和腎癌患者血清中表達(dá)水平顯著升高

如圖1所示，miR-122在腎癌組織中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(t=7.925，P<0.001)，相對于癌旁的正常組織，在51例癌組織樣本中，42例發(fā)生miR-122表達(dá)上調(diào)，上調(diào)率為82.35%。如圖2所示，miR-122在腎癌患者血清中亦呈現(xiàn)顯著高表達(dá)(t=4.32，P<0.001)，在15例配對血清樣本中，miR-122在全部腎癌患者血清中呈高表達(dá)，上調(diào)率為100%。

圖1　　　　miR-122在51例腎癌組織中的相對表達(dá)量

圖2　　　　miR-122在15例腎癌患者血清中的相對表達(dá)量

2.2組織和血清RT-qPCR產(chǎn)物凝膠電泳驗(yàn)證

組織和血清中miR-122熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，組織實(shí)驗(yàn)組(T)和血清實(shí)驗(yàn)組(S)條帶C(cancerous)均要亮于條帶N(normal)，說明與配對的對照樣本相比，miR-122在腎癌組織和腎癌患者血清中的表達(dá)均上調(diào)，與RT-qPCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果相對應(yīng)。

2.3轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitors可抑制腎癌細(xì)胞系的增殖

腎癌細(xì)胞系(ACHN和786-O)在轉(zhuǎn)染miR-122 inhibitors后采用MTT法檢測細(xì)胞系的增殖變化。如圖4中A、B所示，miR-122 inhibitor組細(xì)胞生長曲線與inhibitor control組、mock組細(xì)胞生長曲線有明顯差異；inhibitor control組與mock組之間無顯著差異。采用ANOVA統(tǒng)計(jì)分析顯示miR-122 inhibitors轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速度較其它兩組細(xì)胞下降，說明降低miR-122的表達(dá)可能對腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、786-O的增殖有抑制作用。

M:marker；C:腎癌組織或腎癌患者血清；N:癌旁組織或健康對照者血清; T:組織樣本；S:血清樣本

miR-122 inhibitors轉(zhuǎn)染組與inhibitor control組、mock組之間在同一時(shí)間點(diǎn)的差異分別用*和#來表示，*或者#代表P<0.05，**或者##代表P<0.01

圖4miR-122 inhibitors抑制腎癌細(xì)胞系786-O和ACHN的增殖

2.4腎癌組織中miR-122表達(dá)水平與腎癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

51例腎癌組織樣本分為miR-122高表達(dá)組(36例)和低表達(dá)組(15例),分組的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)方法1.2.2所述進(jìn)行。以55歲為界限，將患者分為兩組。按性別統(tǒng)計(jì)患者中男性與女性的例數(shù)。采用卡方檢驗(yàn)和R×C表Fisher的精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法評估m(xù)iR-122的表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。如表1所示，采用四格表卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，患者年齡、性別因素與miR-122的表達(dá)水平無相關(guān)性(P值均>0.05)；采用R×C表Fisher確切概率計(jì)算發(fā)現(xiàn)，miR-122的表達(dá)水平與患者腫瘤的病理類型和TNM分期亦無顯著相關(guān)性(P值均>0.05)。

表151例腎癌患者癌組織中miR-122的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征病例數(shù)miR-122的表達(dá)水平高表達(dá)低表達(dá)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量P值年齡/歲 ≦55241410 >55272253.2790.070性別 男28208 女231670.0210.884病理類型 透明細(xì)胞癌34268 乳頭狀癌1376 其他#4312.4070.248TNM分期 T1-2N0M0443113 T3-4N0M0431 不明*3210.3971.000

#病理類型不明確；*TNM分期不明確。

3討論

MicroRNAs在正常細(xì)胞與和癌細(xì)胞中的表達(dá)有差異，它們能在一定程度上反映出組織特異性的表達(dá)特征，并且在不同的細(xì)胞及組織環(huán)境中促進(jìn)或者抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，充當(dāng)癌基因或抑癌基因[3,4]。研究特定類型的腫瘤中miRNAs的表達(dá)特征和功能作用為腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后評估提供了方向和策略。MiR-122作為肝臟特異性的微小RNA，其在肝炎相關(guān)的損傷、非酒精性脂肪性肝病、藥物誘導(dǎo)性肝臟疾病和肝臟腫瘤等疾病中的表達(dá)特征、生物學(xué)功能及分子機(jī)制都被深入研究[5-8]。miR-122的表達(dá)在肝臟腫瘤中發(fā)生顯著下調(diào)，對于肝臟腫瘤的形成其主要發(fā)揮抑癌的作用[9]。而在我們前期腎癌組織測序的結(jié)果當(dāng)中，miR-122是表達(dá)最顯著上調(diào)的微小RNA之一，其在10例測序的腎癌組織中平均上調(diào)近25倍[10]。本研究通過對51例配對的腎癌及癌旁組織進(jìn)行RT-qPCR檢測，證實(shí)miR-122在腎癌組織中顯著高表達(dá)，驗(yàn)證了前期我們的測序結(jié)果，提示miR-122在腎癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演促癌的角色。同時(shí)，我們對腎癌患者的血清也進(jìn)行了表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-122在患者血清中也呈現(xiàn)高表達(dá)，與腎癌組織中miR-122表達(dá)水平的檢測結(jié)果相印證。外周血中的miRNAs可以免受核糖核酸酶的降解作用而穩(wěn)定存在是由于受其外周囊泡膜的保護(hù)，因此可以作為一種血清標(biāo)志物而被檢測[11]。MiR-122在15例腎癌患者的血清中都呈現(xiàn)高表達(dá)，提示其可能作為一種腎癌相關(guān)的血清標(biāo)志物而具有早期診斷、預(yù)后評估的潛在臨床價(jià)值。腎癌患者血清中miR-122高上調(diào)率(15/15)的出現(xiàn)可能與所檢測的樣本例數(shù)較少有關(guān)，更大樣本量的血清有待于實(shí)驗(yàn)檢測。

本研究通過在腎癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-122的抑制物，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖改變，來初步探究miR-122在腎癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。在轉(zhuǎn)染了miR-122的抑制物后，細(xì)胞增殖速率降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-122充當(dāng)癌基因而促進(jìn)細(xì)胞增殖的可能性。靶向干擾miR-122的功能可能會(huì)減緩腎癌發(fā)展、起到緩解患者病情的作用。

在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-122，能通過直接靶向降低AKT3的水平來抑制細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用[9]；在乳腺癌中，miR-122通過特異性地降低IGF1R的表達(dá)水平,調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號通路來發(fā)揮腫瘤抑制作用[12]。與之相矛盾，本研究發(fā)現(xiàn)miR-122在腎癌的病理過程中可能發(fā)揮促癌作用。由于miRNAs通常以不完全互補(bǔ)的方式與其靶基因結(jié)合，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，因此同一個(gè)miRNA可能會(huì)有多個(gè)靶基因，能通過不同的信號通路在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不一致甚至截然相反的作用。本實(shí)驗(yàn)組探討了miR-122在腎癌中的表達(dá)和生物學(xué)功能，但對于miR-122的作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)證明了miR-122在腎癌組織中及腎癌患者血清中的高表達(dá)特點(diǎn)，且應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)初步探討了miR-122在腎癌中起促癌作用的可能性，并分析闡明miR-122的相對表達(dá)水平與所選樣本的臨床病理特征無顯著相關(guān)性。以上研究初步討論了miR-122在腎癌病理過程中可能的重要作用和意義，為后續(xù)深入研究其在腎癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為將miR-122作為腎臟腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)提供了參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The abnormal expression of miR-122 in human renal cell carcinoma and its clinical significance

CAOTuo,ZHAOChun-juan,YUZhen-dong.

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityShenzhenHospital,Shenzhen518036,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression levels of miR-122 in the tumor tissues and sera of patients with renal cell carcinoma and analyze its clinical significance.MethodsTotal RNAs from 51 pairs of human renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues were isolated and used for synthesis of the first-strand cDNA.Meanwhile,15 pairs of serum samples from cancer patients and matched healthy control subjects were subjected to RNA isolation and reverse transcription.The expression levels of miR-122 were analyzed by quantitative real-time PCR.Then,the relationship between the expression level of miR-122 in tumor tissue and clinicopathological characteristic was investigated.Furthermore,ACHN and 786-O cell lines were transfected with miR-122 inhibitors for characterization of the biological function of miR-122.ResultsCompared with the corresponding adjacent tissues and matched serum controls,the expression levels of miR-122 in tumor tissues and patients’ sera were significantly increased,with calculated ratio of upregulation at 82.35 percent and 100 percent,separately.However,there’s no correlation between the expression level of miR-122 and the age,gender,pathological classification and TNM stage of patients with renal cell carcinoma.MTT assay showed that tumor cells transfected with synthesized miR-122 inhibitors proliferated at a lower rate than that of control groups.ConclusionmiR-122 may be involved in the development and progression of renal cell carcinoma.This study of miR-122 expression may display potential application significance for the early diagnosis and treatment of renal cell carcinoma.

Key words:microRNAs;miR-122;renal cell carcinoma

(收稿日期：2015-01-29)

中圖分類號：R737.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

*通訊作者

基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140415162543037)；深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目(201401049)

文章編號：1007-4287(2016)04-0559-05