孫楊，聶簡(jiǎn)琪，劉秀霞，楊艷坤，戴曉峰，白仲虎（糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

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生物過程工程研究在創(chuàng)新生物醫(yī)藥開發(fā)中應(yīng)用的驅(qū)動(dòng)力
——生物反應(yīng)器

孫楊，聶簡(jiǎn)琪，劉秀霞，楊艷坤，戴曉峰，白仲虎
（糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

摘要：近年創(chuàng)新生物醫(yī)藥在生物產(chǎn)業(yè)中的比重逐漸增大，也給生物產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，靶點(diǎn)篩選及分子構(gòu)建等上游技術(shù)的進(jìn)步是促進(jìn)生物醫(yī)藥進(jìn)步的主要原因。隨著目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物醫(yī)藥生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的要求也不斷提高，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)現(xiàn)載體——生物反應(yīng)器的技術(shù)改進(jìn)和創(chuàng)新也越發(fā)凸顯其重要性。本文介紹了生物反應(yīng)器在創(chuàng)新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用種類、發(fā)展趨勢(shì)及發(fā)展驅(qū)動(dòng)力，回顧了全球范圍內(nèi)新型生物反應(yīng)器的發(fā)展成果，包括新型反應(yīng)器技術(shù)及過程分析技術(shù)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，最后，分析了中國(guó)生物反應(yīng)器的發(fā)展現(xiàn)狀與問題，指出了生物反應(yīng)器的發(fā)展與進(jìn)步應(yīng)以提高生物培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性最終提高產(chǎn)品的質(zhì)量而不是以提高產(chǎn)量為主要目標(biāo)。本文詳細(xì)闡述現(xiàn)代生物反應(yīng)器技術(shù)及基于“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的質(zhì)量控制理念在其中所起到的關(guān)鍵作用，以及生物反應(yīng)器的技術(shù)發(fā)展的現(xiàn)狀和未來走向。

關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器；生物過程工程；質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；過程分析技術(shù)；創(chuàng)新生物醫(yī)藥；生物工程；微反應(yīng)器

第一作者：孫楊（1988—），男，博士研究生，研究方向主要為生物過程工程研究及高通量技術(shù)應(yīng)用。聯(lián)系人：白仲虎，教授，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域包括QbD導(dǎo)向的生物過程工程優(yōu)化策略及高通量生物反應(yīng)器的研發(fā)、治療性抗體片段藥物的開發(fā)、臨床免疫分析技術(shù)產(chǎn)品的研發(fā)等。E-mail baizhonghu@jiangnan.edu.cn。

近20年來全球工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，尤其是生物醫(yī)藥和大宗化學(xué)品的生物制造技術(shù)產(chǎn)業(yè)。全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，據(jù)美國(guó)相關(guān)機(jī)構(gòu)2013年統(tǒng)計(jì)全球生物醫(yī)藥產(chǎn)值約1997億美元[1-2]，在2010—2020年間將保持年均速13.5％左右，到2020年接近5000億美元的產(chǎn)值[3]。而基于“細(xì)胞培養(yǎng)”技術(shù)的蛋白質(zhì)醫(yī)藥已成為生物醫(yī)藥的重要組成部分[4]，中國(guó)生物醫(yī)藥市場(chǎng)未來5～10年的發(fā)展主流也將會(huì)與世界生物技術(shù)藥物發(fā)展方向一樣，重點(diǎn)發(fā)展重組蛋白藥物，尤其是基于哺乳細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人源化和全人源治療性抗體產(chǎn)業(yè)的顯著進(jìn)步[5-6]，目前輝瑞、葛蘭素史克、強(qiáng)生等國(guó)際創(chuàng)新生物醫(yī)藥研發(fā)機(jī)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)過程工程研究中確實(shí)取得了巨大的進(jìn)步和發(fā)展。這些發(fā)展也同樣推動(dòng)了生物醫(yī)藥開發(fā)中過程工程研究從方法學(xué)到技術(shù)手段的飛速進(jìn)步。生物醫(yī)藥過程工程開發(fā)、研究策略和方法的發(fā)展體現(xiàn)在硬件技術(shù)平臺(tái)和理念兩個(gè)方面。硬件方面指的是實(shí)施規(guī)?；锓磻?yīng)的核心裝置生物反應(yīng)器，理念指的是ICH Q8、Q10和Q11中所提倡的“設(shè)計(jì)決定質(zhì)量”（quality by design，QbD），并在產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性為主要目標(biāo)下達(dá)到生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程研發(fā)和產(chǎn)品質(zhì)量控制的目的[7-10]。本文從生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀、市場(chǎng)規(guī)模、未來發(fā)展趨勢(shì)入手，闡述現(xiàn)代生物反應(yīng)器技術(shù)及基于QbD的質(zhì)量控制理念在其中所起到的關(guān)鍵作用，以及生物反應(yīng)器的技術(shù)發(fā)展的現(xiàn)狀和未來走向。

1　生物反應(yīng)器在創(chuàng)新生物醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用中的種類、發(fā)展驅(qū)動(dòng)力與發(fā)展趨勢(shì)

1.1生物反應(yīng)器的類型與應(yīng)用

目前生物醫(yī)藥開發(fā)技術(shù)的基礎(chǔ)研究和工業(yè)化技術(shù)在過去十幾年里突飛猛進(jìn)，鑒于生物反應(yīng)體系的多樣性和目標(biāo)的復(fù)雜性，生物反應(yīng)器發(fā)展出諸多的種類。截至目前，應(yīng)用于創(chuàng)新醫(yī)藥開發(fā)的生物反應(yīng)器的相關(guān)基礎(chǔ)技術(shù)研究、產(chǎn)品設(shè)計(jì)創(chuàng)新、制造技術(shù)革新是一個(gè)全球范圍內(nèi)的關(guān)注熱點(diǎn)。表1根據(jù)主要生物反應(yīng)器的生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域?qū)ι锓磻?yīng)器的分類做出簡(jiǎn)要總結(jié)。

1.2全球范圍內(nèi)生物反應(yīng)器發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力

全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和新型治療技術(shù)手段日新月異的發(fā)展對(duì)規(guī)?；溉榧?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提出了更高的要求。包括生產(chǎn)效率的提高、產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、生產(chǎn)過程成本的控制。例如在人源化治療性抗體的發(fā)展，全球治療性抗體市場(chǎng)在2011年已達(dá)到446億美元，并保持5.3％的年增速，預(yù)計(jì)在2016年將達(dá)到600億美元市場(chǎng)總值。

各種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術(shù)中占據(jù)了絕對(duì)控制的地位。從1995—2011年間，歐盟醫(yī)藥管理局（EMA）所批準(zhǔn)的所有生物醫(yī)藥中，78.3％需要用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)，而生物反應(yīng)器是實(shí)現(xiàn)各類細(xì)胞培養(yǎng)的基石。CHO細(xì)胞、大腸桿菌、酵母細(xì)胞占到了歐盟EMA所批準(zhǔn)的生物藥生產(chǎn)用細(xì)胞系的83.4％以上。各種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)生物反應(yīng)器有著不一樣的技術(shù)要求和培養(yǎng)規(guī)模需要[12]。

全球生物過程工程的研發(fā)理念進(jìn)步巨大。目前國(guó)際上生物醫(yī)藥研發(fā)巨頭如輝瑞、GSK、強(qiáng)生等醫(yī)藥生產(chǎn)研發(fā)公司等在推動(dòng)創(chuàng)新生物醫(yī)藥發(fā)展過程中，也推動(dòng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程工程的研究理念和方法的進(jìn)步。這些進(jìn)步是從技術(shù)手段、方法、研究理念和目標(biāo)等方面與傳統(tǒng)工業(yè)生物技術(shù)的開發(fā)有所區(qū)別。其中主要的理論來源是人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議ICH（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use）公布的標(biāo)準(zhǔn) Q8、Q10和Q11中提倡的“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的概念，其主要是指在具體實(shí)施生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程研發(fā)及質(zhì)量控制的過程中，要以產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量為最高的目標(biāo)，其具體的實(shí)施過程是前期通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（design of experiment，DoE）、多變?cè)獏?shù)分析（multivariate analysis，MVA）和過程分析技術(shù)（process analytical technology，PAT）以及對(duì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)代謝生理學(xué)的研究基礎(chǔ)上對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)的整個(gè)過程有一個(gè)深入的了解，通過以上技術(shù)手段確定產(chǎn)品生產(chǎn)過程中與質(zhì)量相關(guān)的關(guān)鍵過程參數(shù)（critical process attributes，CPAs），收集多次細(xì)胞培養(yǎng)過程的過程參數(shù)，建立培養(yǎng)過程批式模型，最終建立細(xì)胞培養(yǎng)過程關(guān)鍵過程參數(shù)和保證產(chǎn)品質(zhì)量的過程設(shè)計(jì)空間，以獲得在產(chǎn)品生產(chǎn)過程細(xì)胞培養(yǎng)控制的可執(zhí)行方案，最終實(shí)現(xiàn)在生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程中，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的控制不只是對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)控制，主要是實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過程的空間設(shè)計(jì)及過程監(jiān)控。但是在實(shí)施多變?cè)侥Ｐ偷慕⑦^程中，考慮到生物醫(yī)藥過程研究高成本的因素，希望建立一個(gè)合適合理的過程縮?。╯cale down）策略，通過實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)建立過程空間模型來指導(dǎo)生產(chǎn)規(guī)?？刂?。而這些過程縮小策略也必須依賴于生物反應(yīng)器的技術(shù)進(jìn)步，最新的生物反應(yīng)器技術(shù)手段發(fā)展包括：細(xì)胞株篩選與評(píng)價(jià)中采用高通量培養(yǎng)技術(shù)，基于微型生物反應(yīng)器的平行培養(yǎng)技術(shù)，以及基于微流控的微型生物反應(yīng)器技術(shù)。生物過程工程研究理念的革新，可以大大提高生物過程工程研究的效率。目前在蛋白質(zhì)醫(yī)藥研究的過程開發(fā)中，可以達(dá)到在數(shù)月內(nèi)，快速實(shí)現(xiàn)“從DNA到成熟工藝”的整個(gè)開發(fā)過程。

1.3生物反應(yīng)器的技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)與市場(chǎng)

1.3.1一次性生物反應(yīng)器

在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)工藝要求的條件下，為提高生產(chǎn)過程的靈活性、降低過程污染、減少規(guī)定設(shè)備的巨大資金投入、有效控制產(chǎn)品開發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，近10年來，一次性生物反應(yīng)器（disposable bioreactor）是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中生物反應(yīng)器的最為突出的發(fā)展方向[13-15]。用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的攪拌式（STR）一次性生物反應(yīng)器的工作體積已經(jīng)可以達(dá)到2000L的規(guī)模；波浪式（wave bag）一次性生物反應(yīng)器的體積也可以達(dá)到1000L的規(guī)模；用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的固定床式的一次性生物反應(yīng)器體積也已達(dá)到500L的規(guī)模。圖1總結(jié)了目前國(guó)外的幾種主要一次性生物反應(yīng)器和其工作體積。

近年來由于免疫細(xì)胞治療技術(shù)在臨床應(yīng)用方面取得了突破性的進(jìn)展，比如DC-CIK細(xì)胞治療和嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)（CAR-T）[16-17]針對(duì)病人個(gè)體的T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，也進(jìn)一步擴(kuò)展了一次性生物反應(yīng)器的應(yīng)用范圍。事實(shí)上體積相對(duì)較小的一次性生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)胞免疫治療這個(gè)新興治療技術(shù)的廣泛臨床應(yīng)用將起到巨大的技術(shù)支撐作用。

圖1　國(guó)外幾種主要供應(yīng)商生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)用一次性生物反應(yīng)器

全球一次性生物反應(yīng)器的市場(chǎng)規(guī)模在2014年就達(dá)到了2.02億美元，并將保持18.4％的增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)在2019年達(dá)到4.7億美元。目前一次性生物反應(yīng)器的市場(chǎng)主要集中在北美和西歐，預(yù)計(jì)在未來的5年內(nèi)，新興國(guó)家的一次性生物反應(yīng)器市場(chǎng)會(huì)快速增長(zhǎng)[18]。國(guó)際上的主要一次性生物反應(yīng)器供應(yīng)商為：Thermo Fischer Scientific，Inc.（美國(guó)），Sartorius AG（德國(guó)），Merck KGaA（德國(guó)），GE Healthcare（美國(guó)）以及Pall Corporation（美國(guó)）。我國(guó)在此技術(shù)領(lǐng)域尚屬剛剛起步階段，尚無規(guī)模化生產(chǎn)能力。

1.3.2高通量微型生物反應(yīng)器

表2　傳統(tǒng)生物過程工程研究中的技術(shù)手段及實(shí)驗(yàn)流程與現(xiàn)代生物過程工程研究需要的矛盾對(duì)比

微型生物反應(yīng)器的技術(shù)進(jìn)步是生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)的另一個(gè)顯著特點(diǎn)。研究生物反應(yīng)器的微型化、平行化以及自動(dòng)化，以適應(yīng)與生物過程工程研究的高通量需求，是近10年來生物過程工學(xué)科內(nèi)相關(guān)科學(xué)儀器研究的一個(gè)熱點(diǎn)[19-21]。其驅(qū)動(dòng)力來自傳統(tǒng)意義上的過程研究技術(shù)手段已無法滿足現(xiàn)代生物過程工程的技術(shù)需求。傳統(tǒng)的生物過程工程研究流程與技術(shù)手段與現(xiàn)代生物過程研究需要的矛盾總結(jié)于表2。由表中可以發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)方法采用的是“串行”流程，效率和針對(duì)細(xì)胞克隆研究的通量均較低，無法滿足現(xiàn)在生物過程工程研究的需要。針對(duì)表2中指出的這些矛盾，目前國(guó)外在高通量平行細(xì)胞培養(yǎng)儀器研究主要集中在兩個(gè)核心點(diǎn)：①為提高培養(yǎng)的通量，盡量減小反應(yīng)器體積，即采用不同形式的微型（毫升甚至微升級(jí)）生物反應(yīng)器[22]；②為對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過程有深刻的理解，在高通量培養(yǎng)過程中，盡量實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同形式的高通量平行細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)被報(bào)道，或者已經(jīng)成功商業(yè)化。但是，限于目前工業(yè)技術(shù)和相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)發(fā)展的現(xiàn)狀，鮮見能夠完美地同時(shí)解決上述兩個(gè)問題的系統(tǒng)。也有一些系統(tǒng)為了同時(shí)考慮到解決這兩個(gè)方面的需要，降低儀器系統(tǒng)的普適性，僅針對(duì)一類細(xì)胞的培養(yǎng)，比如美國(guó)的SIMCELLTM（Bioprocessors，Woburn，MA 01801，USA）微流體反應(yīng)器系統(tǒng)僅適用于哺乳細(xì)胞，英國(guó)的Ambr（TPA Biosystems，UK）微反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也僅針對(duì)哺乳細(xì)胞培養(yǎng)。

2　全球范圍內(nèi)新型生物反應(yīng)器發(fā)展成果

2.1用于生物過程開發(fā)的微型生物反應(yīng)器和一次性生物反應(yīng)器

高通量的微型生物反應(yīng)器在生物過程工程開發(fā)中起著越來越重要的作用[23]。近10年來，已商業(yè)化生產(chǎn)的該類生物反應(yīng)器種類繁多，比如10mL級(jí)的微型生物反應(yīng)ambrTM15和ambrTM250系統(tǒng)（Sartorius）、100mL級(jí)的德國(guó)Dasgip平行細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、Applikon的Mini-bioreactor、瑞士Inforis公司的平行細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等。這種形式的生物反應(yīng)器具有高度的過程操作靈活性，可以完全模擬大型規(guī)模化反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，可以平行開展多個(gè)培養(yǎng)條件下的過程，可以實(shí)施批式、流加批式、連續(xù)培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。該形式的反應(yīng)器可用于疫苗生產(chǎn)的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和微載體細(xì)胞培養(yǎng)過程，也可以應(yīng)用于CHO細(xì)胞培養(yǎng)的治療性抗體生產(chǎn)和各種微生物細(xì)胞的培養(yǎng)。以病毒疫苗生產(chǎn)為例，在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒疫苗[24]，VERO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)HSV I和Polio I病毒疫苗[25]的生產(chǎn)過程，VERO細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒疫苗[26]，HEK293懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬病毒疫苗[27]等。

2.1.1纖維載體的固定床反應(yīng)器（ATMI LifeSciences 的iCELLis?）

ATMI LifeSciences的iCELLis?是第一個(gè)完全一體化，一次性使用的高細(xì)胞密度生物反應(yīng)器[28]。它是由醫(yī)用級(jí)的聚脂微纖維（polyester microfibers）作為微載體，微載體壓縮后固定于固定床上，纖維狀載體比表面積非常高，相對(duì)于傳統(tǒng)的STR反應(yīng)器來說，達(dá)到相同數(shù)目的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，可以使細(xì)胞培養(yǎng)體積降低20倍以上（表3）。反應(yīng)器設(shè)計(jì)操作極為簡(jiǎn)單方便，大大降低了傳統(tǒng)STR反應(yīng)器用于微載體細(xì)胞培養(yǎng)過程中的一些耗時(shí)操作，比如設(shè)備滅菌、微載體的處理等[29-31]。在使用iCELLis用于細(xì)胞培養(yǎng)可以省去逐級(jí)培養(yǎng)放大過程，可以在較低的細(xì)胞濃度下接種，比如，使用6個(gè)傳統(tǒng)滾動(dòng)瓶培養(yǎng)（1750cm2）就足夠用于接種iCELLis 1000生物反應(yīng)器（55L）。在培養(yǎng)過程中磁力攪拌驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)基在固定床中均勻分布，這種攪拌形式可以有效地減小細(xì)胞受到剪切力的機(jī)械損傷，從而可以增大培養(yǎng)過程活細(xì)胞比例。iCELLis的氧傳遞模式是一種獨(dú)特的“瀑布”式傳氧策略，這種形式是使培養(yǎng)基由反應(yīng)器底部運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)器頂部，再由頂部以薄膜的形式從外壁滑落，使固定床上的載體能不斷的充分與新鮮的培養(yǎng)基接觸，實(shí)現(xiàn)氧的傳遞，保證了反應(yīng)器內(nèi)的傳氧系數(shù)kLa保持較高水平。并且iCELLis采用了一次性固定床反應(yīng)系統(tǒng)，下游純化階段無需離心分離細(xì)胞，iCELLis反應(yīng)器系統(tǒng)的固定床結(jié)構(gòu)如圖2所示。

表3　iCELLis固定床細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器驗(yàn)證研究結(jié)果

2.1.2一次性細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器

一次性生物反應(yīng)器以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)中逐漸的得到推廣與應(yīng)用，例如一次性波浪式細(xì)胞培養(yǎng)袋是由Wave Bioreactor公司在十幾年前（現(xiàn)在屬于GE Healthcare）引入的一種獨(dú)特的一次性細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器[32-33]。在實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可以實(shí)施平行的多數(shù)量的該種形式的反應(yīng)器（multiple bag-type bioreactors），類似的產(chǎn)品也有好多種，例如：荷蘭Applikon公司的AppliFlex、CELLution Biotech的CELL-tainer，德國(guó)Sartorious的BIOSTAT CultiBag、MetBio、PadReactor公司的Optima and OrbiCell培養(yǎng)袋等。

這種形式的一次性細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器已被用于臨床細(xì)胞免疫治療[34-35]中的T細(xì)胞培養(yǎng)，這種反應(yīng)器由于體積小、全封閉、一次性使用，特別適合臨床上對(duì)多個(gè)病人的個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)擴(kuò)增，它將對(duì)細(xì)胞免疫治療，包括CAR-T這種新興的個(gè)體化醫(yī)療手段的普及，起到巨大的支撐作用。

由一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋開始，目前一次性生物反應(yīng)器的規(guī)?？梢赃_(dá)到噸級(jí)，形式也拓展到STR的形式[36]。比如GE的Xcellerex[37]一次性STR生物反應(yīng)器XDR-50～2000。它是單容器模塊化的、可放大的一次使用生物反應(yīng)器，具有標(biāo)準(zhǔn)攪拌式反應(yīng)器的表現(xiàn)，可以滿足從工藝開發(fā)到生產(chǎn)的全過程需要。

圖2　iCELLis細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器系統(tǒng)的固定床結(jié)構(gòu)圖

一次性的生物反應(yīng)器已成為了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)之一，尤其是生物技術(shù)本身的發(fā)展，顯著提高了細(xì)胞系的表達(dá)量，比如CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)治療性抗體的表達(dá)水平已經(jīng)可以達(dá)到10 g/L的水準(zhǔn)，所以生產(chǎn)上對(duì)于培養(yǎng)體積的要求顯著減少，因而一次性生物反應(yīng)器的培養(yǎng)規(guī)模已經(jīng)可以用于規(guī)模化生產(chǎn)。圖3總結(jié)了一次性細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的發(fā)展歷程。這種生物反應(yīng)器在個(gè)性化治療的免疫細(xì)胞培養(yǎng)過程中有很好的應(yīng)用前景[38]。

根據(jù)Genetic Engineering & Biotechnology News（GEN）在2015年7月做的調(diào)查報(bào)告顯示一次性生物過程工程裝置（包括上、下游）在2013— 2018期間的年增長(zhǎng)率將保持38％。50％被調(diào)查的公司表示使用量最大的和增長(zhǎng)最快的一次性生物過程裝置為配液系統(tǒng)，其次是哺乳細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，排在第三位的是生物反應(yīng)器的輔助設(shè)備——一次性在線過程參數(shù)檢測(cè)傳感器，令人驚訝的是有20％的被調(diào)查公司認(rèn)為一次性微生物生物反應(yīng)器將保持快速增長(zhǎng)。

圖3　一次性細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的發(fā)展歷程

2.1.3微流體培養(yǎng)系統(tǒng)

微流體培養(yǎng)系統(tǒng)（microfluidic culture system）：微流體技術(shù)目前在生物行業(yè)的到了廣泛的應(yīng)用，如基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、基于流式細(xì)胞儀的單液滴細(xì)胞分選等，而在用于細(xì)胞培養(yǎng)的微流體裝置被稱為微型生物反應(yīng)器[39]，比如Smart Biosystems公司生產(chǎn)的IVFLAB-6微流體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，CellASCIS公司開發(fā)的ONIX微流體灌注細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，美國(guó)Bioprocessors公司的SimCellTM微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)和Hurel公司的HurelFlow微流控生物反應(yīng)器等。這些基于微流控的微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)主要用于開展細(xì)胞培養(yǎng)過程的優(yōu)化研究和細(xì)胞克隆的高通量篩選，可以顯著提高細(xì)胞克隆篩選過程的效率與生產(chǎn)過程優(yōu)化效率。

例如SimCell高通量細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由4個(gè)獨(dú)立模塊組成：①反應(yīng)器的溫控和混合攪拌是由5個(gè)培養(yǎng)箱模塊控制；②傳感器模塊通過非接觸式pH、溶氧（DO）電極提供溶氧和pH參數(shù)的測(cè)量；③取樣模塊功能為從指定反應(yīng)器內(nèi)取樣并轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)多孔板，用于離線參數(shù)的分析；④加液模塊實(shí)現(xiàn)同時(shí)向每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)滴加8種液體溶液。實(shí)現(xiàn)補(bǔ)料、流加培養(yǎng)基、pH控制時(shí)的酸堿補(bǔ)加等功能；⑤第五個(gè)模塊是自動(dòng)化機(jī)器人系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)以上4個(gè)模塊的整合及自動(dòng)化操作。SIMCELL的微反應(yīng)器工作體積為300～800μL，可開展平行培養(yǎng)的最大細(xì)胞克隆通量可達(dá)1260個(gè)/批次。圖4是該系統(tǒng)微型生物反應(yīng)器、系統(tǒng)操作模塊的簡(jiǎn)要示意圖。高通量微型生物反應(yīng)器開展細(xì)胞水平培養(yǎng)的過程工程研究，是生物醫(yī)藥過程工程研究技術(shù)的發(fā)展方向之一。

圖4　SimCell系統(tǒng)（美國(guó)Bioprocessors公司）工作原理圖、及生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和模塊集成

圖5　常州英德高通量培養(yǎng)系統(tǒng)

2.1.4高通量細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

我國(guó)在此領(lǐng)域尚屬起步階段，目前國(guó)內(nèi)高通量微型生物反應(yīng)器主要處于研發(fā)推廣階段，主要有常州英德生物科技有限公司推出的高通量細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，如圖5，包括高通量細(xì)胞培養(yǎng)搖床及與之結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化移液、接種、取樣等功能的高通量移液工作站。該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)基于“三明治板蓋”培養(yǎng)方式的高通量平行細(xì)胞培養(yǎng)，并可在移液工作站的配合下實(shí)現(xiàn)快速的取樣以便用于檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞庫的快速評(píng)價(jià)，最高通量可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)4608個(gè)克隆進(jìn)行篩選，但此系統(tǒng)無法進(jìn)行在線參數(shù)監(jiān)控與控制。

2.2生物過程分析技術(shù)的進(jìn)步

2.2.1過程分析技術(shù)的概念

生物反應(yīng)器廣泛采用過程分析技術(shù)（process analytical technology，PAT）[40-41]以提高人們對(duì)反應(yīng)器內(nèi)復(fù)雜生物反應(yīng)過程的及時(shí)、準(zhǔn)確、深入的理解，進(jìn)而達(dá)到控制生物過程質(zhì)量的目的，是近年來全球范圍內(nèi)生物反應(yīng)器技術(shù)的一個(gè)顯著進(jìn)步。

過程分析技術(shù)在化學(xué)藥物和生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程中廣泛采用的主要推動(dòng)者是美國(guó)FDA和歐盟EMA。他們對(duì)PAT的定義是：一種通過及時(shí)測(cè)量影響關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)（critical quality attributes，CQA）的關(guān)鍵過程參數(shù)（critical process attributes，CPAs）的一系列技術(shù)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)制藥過程的分析、設(shè)計(jì)和控制。PAT的概念實(shí)際上定位于關(guān)鍵過程參數(shù)的及時(shí)監(jiān)測(cè)（在線、在位和離線），在生物反應(yīng)過程中的最大價(jià)值是實(shí)現(xiàn)對(duì)生物反應(yīng)過程本身的質(zhì)量控制，而不是傳統(tǒng)意義上的僅對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行控而不是傳統(tǒng)意義上的僅對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行控制，以達(dá)到所謂設(shè)計(jì)決定質(zhì)量的效果。所以可以這樣認(rèn)為：PAT不單單是系列技術(shù)手段，它是一種以QbD為核心的技術(shù)理念[42- 43]。

2.2.2過程分析技術(shù)與裝置

較為傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)和新近發(fā)展起來的在線、在位、離線檢測(cè)技術(shù)總結(jié)于表4。這些檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合使用，通過及時(shí)理解細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、生產(chǎn)的生理學(xué)狀態(tài)參數(shù)和反應(yīng)器內(nèi)物化環(huán)境參數(shù)，可以對(duì)給定的生物過程有一個(gè)較為全面的理解。

目前最顯著的發(fā)展趨勢(shì)是使用光譜分析技術(shù)，通過在反應(yīng)器內(nèi)在反應(yīng)器內(nèi)安置傳感器，通過光纖傳輸光譜信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、生產(chǎn)的生理學(xué)狀態(tài)參數(shù)的實(shí)時(shí)在線分析，應(yīng)用最廣泛的是拉曼光譜和近遠(yuǎn)紅外光譜（NIR）。這兩個(gè)PAT技術(shù)手段是以QbD為導(dǎo)向的生物過程研究與實(shí)際操作的重要支撐。

表4　傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)和新近發(fā)展起來的在線、離線檢測(cè)技術(shù)總結(jié)

國(guó)際上主要的拉曼光譜在線檢測(cè)裝置供應(yīng)商是Kaiser Optical Systems公司，產(chǎn)品為RamanRxn3?。NIR的一個(gè)主要供應(yīng)商是Sartorius Stedim North America，該公司的主要NIR在線檢測(cè)系統(tǒng)是BioPAT?Spectro。BioPAT Spectro每15s間隔，在950～1750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液做一次掃描，再通過預(yù)先建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)營(yíng)養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物、產(chǎn)品、細(xì)胞活性等過程參數(shù)實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。NIR光譜和拉曼光譜數(shù)據(jù)會(huì)產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)結(jié)合其他檢測(cè)技術(shù)所獲得的在線、位、離線參數(shù)，作為輸入變量組，輸入MVA軟（SIMCA，件瑞典Umetrics公司）[44]，通過研發(fā)階段的多次數(shù)據(jù)收集，建立過程批式模型和過程操作空間。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，操作者可以通過實(shí)時(shí)PAT檢測(cè)，通過MVA數(shù)據(jù)分析，對(duì)過程狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)綜合判斷，并可以及時(shí)分析出導(dǎo)致過程偏差的原因。這種PAT技術(shù)加上多變?cè)治鍪侄?，可以使我們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行真正意義上的生物過程質(zhì)量檢測(cè)、分析與控制。MVA技術(shù)是PAT技術(shù)應(yīng)用的數(shù)據(jù)處理基礎(chǔ)。這種關(guān)系詳見圖6。

圖6　PAT技術(shù)與MVA數(shù)據(jù)處理手段在過程質(zhì)量控制中的應(yīng)用

3　我國(guó)生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與問題

中國(guó)作為生物發(fā)酵產(chǎn)品大國(guó)，生物醫(yī)藥的需求大國(guó)，以及潛在的生物醫(yī)藥創(chuàng)新與生產(chǎn)大國(guó)，生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)具有極大發(fā)展?jié)摿Α５遣豢煞裾J(rèn)的事實(shí)是在我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)中，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等中下游技術(shù)是我國(guó)最薄弱的技術(shù)環(huán)節(jié)，我國(guó)生物醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化與先進(jìn)國(guó)家的差距較大，滯后的一個(gè)重要原因就是缺乏配套工藝的工業(yè)化放大技術(shù)和相應(yīng)的以生物反應(yīng)器為核心裝備的技術(shù)支撐系統(tǒng)。我國(guó)目前主要生產(chǎn)一些中低檔生物反應(yīng)器，并且這些反應(yīng)器主要針對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)中的微生物培養(yǎng)。而在生物醫(yī)藥生產(chǎn)用的高端哺乳細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器研發(fā)與制造方面，跟蹤國(guó)際上生物反應(yīng)器的技術(shù)進(jìn)步所做的努力非常有限。這主要由兩方面原因：一方面是國(guó)家政策導(dǎo)向，尤其是新藥審批政策的導(dǎo)向問題；另一方面是生物醫(yī)藥產(chǎn)品的高附加值使得生產(chǎn)企業(yè)可以承受較高的設(shè)備成本，導(dǎo)致生產(chǎn)企業(yè)不愿冒險(xiǎn)嘗試國(guó)產(chǎn)生物反應(yīng)器裝置，對(duì)于反應(yīng)器生產(chǎn)企業(yè)而言市場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力不大。可以說，目前我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中用于哺乳細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)治療性抗體和人用疫苗的生物反應(yīng)器幾乎完全依賴進(jìn)口，主要供應(yīng)商集中在國(guó)際上幾個(gè)著名公司，包括Sartorius、GE、Simens、Eppendorf、Applikon，只是最近在哺乳細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)畜用疫苗領(lǐng)域有了一些突破，即在2015年，成都英德生物醫(yī)藥裝備技術(shù)有限公司為我國(guó)的口蹄疫疫苗生產(chǎn)線（蘭州中農(nóng)威特），完全自主生產(chǎn)、設(shè)計(jì)、安裝了單罐批培養(yǎng)體積達(dá)到6000 L的VERO細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器和配套裝置。并且目前我國(guó)對(duì)于生物醫(yī)藥過程工程的研究理念與發(fā)達(dá)國(guó)家也有一些差距，我國(guó)目前還停留在以提高產(chǎn)量為目的的基礎(chǔ)上，但對(duì)于生物醫(yī)藥產(chǎn)品，生產(chǎn)過程的穩(wěn)定性、最終產(chǎn)品的質(zhì)量比產(chǎn)量更重要，而質(zhì)量的控制在工藝開發(fā)階段就要得到重視，我國(guó)就需要在此集中力量，努力改變此領(lǐng)域的現(xiàn)狀。

4　結(jié)語

生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步必定會(huì)促進(jìn)生物醫(yī)藥開發(fā)的進(jìn)步，而創(chuàng)新生物醫(yī)藥的發(fā)展，在促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，完善疾病治療手段及方案的同時(shí)，也會(huì)促進(jìn)生物過程工程研究的進(jìn)步，由此帶來的進(jìn)步表現(xiàn)在：硬件上，PAT技術(shù)在生物反應(yīng)器技術(shù)上的不斷開發(fā)及應(yīng)用；軟件上，QbD理念在生物醫(yī)藥生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用。目前，隨著一次性生物反應(yīng)器，微型生物反應(yīng)器等新型生物反應(yīng)器的發(fā)展與啟示，在生物醫(yī)藥技術(shù)作為國(guó)家發(fā)展核心競(jìng)爭(zhēng)力而越來越得到重視之時(shí)，如何實(shí)現(xiàn)技術(shù)創(chuàng)新、產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新、產(chǎn)品創(chuàng)新，值得大家思考和共同努力。

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綜述與專論

Pioneering application of biological process engineering in innovative bio-pharmaceutical development——bioreactors

SUN Yang，NIE Jianqi，LIU Xiuxia，YANG Yankun，DAI Xiaofeng，BAI Zhonghu
（National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Abstract：In recent years，the proportion of innovative biomedical in the biotechnology industry has been increasing gradually，which is mainly due to the improvement of upstream technology such as target screening and molecule construction and brings tremendous economic benefit. With the increasing applications of cell culture technology in biomedical industry，demand for its innovation has been increasing. And so it is with the equipment bioreactors. This review introduced the categories，development trend and driving force of bioreactors in biomedical industry. The achievements of novel bioreactors including the applications of novel bioreactor technology and process analytical technology are also summarized. Finally，we discussed the development status and problems of bioreactor industry in China and pointed out that increasing the product quality rather than production is the goal of bioreactor development. This review also expounded the key role of modern bioreactor technology and the “Quality by Design”principles of ,as well as the developmenet status and trend of bioreactor technology.

Key words：bioreactor; biological process engineering; quality by design; PAT; innovative biopharmaceutical; biological engineering; microreactor

中圖分類號(hào)：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）04–0971–10

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.001

收稿日期：2015-12-16；修改稿日期：2016-01-06。

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2015AA020802）及中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（JUSRP51401A）項(xiàng)目。