呂連杰　亢建民(天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津　300070)

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五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響

呂連杰亢建民1(天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070)

〔摘要〕目的探討五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。方法人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株U251置于胎牛血清中培養(yǎng)，分為觀察組和對照組。觀察組應(yīng)用五味子多糖作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，對照組未應(yīng)用任何藥物作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。四甲基偶氮唑藍(lán)比色( MTT)法觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。RT－PCR觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期素( cyclin) B1 mRNA、原癌基因( c－Myc) mRNA的影響。Western印跡觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響。結(jié)果培養(yǎng)48 h后，觀察組不同濃度用藥組OD570值均低于對照組，且隨著用藥濃度的上升，五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸加強趨勢。觀察組cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA相對表達(dá)量均低于對照組( P＜0．05)。觀察組cyclin B1、c－Myc蛋白表達(dá)量均低于對照組( P＜0．05)。結(jié)論五味子多糖能夠有效抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，這可能與五味子多糖抑制cyclin B1與c－Myc的表達(dá)作用有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞;五味子多糖;細(xì)胞增殖; cyclin B1; c－Myc

1天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者:呂連杰( 1976－)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療。

神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在臨床上并不常見，但是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者的死亡率十分高〔1〕。膠質(zhì)細(xì)胞瘤屬于神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，往往需要至腫瘤的中晚期方可被確診，目前臨床上外科手術(shù)無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，部分患者術(shù)后生存期甚至不足1年〔2〕。因此，在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療過程中應(yīng)用有效的藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖十分關(guān)鍵。五味子多糖從五味子干燥成熟果實中提取而來〔3〕，對肝癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、甲狀腺癌〔6〕等腫瘤具有十分強的抗癌活性。本文主要探討五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。

1資料與方法

1. 1主要試劑五味子多糖由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供，人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購自上海樊克生物科技有限公司。

1. 2細(xì)胞培養(yǎng)及分組將人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞置于胎牛血清( BSA)的RPMI－1640培養(yǎng)液中，在37℃濃度為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)，密切觀察U251細(xì)胞的生長情況。在細(xì)胞生長密度＞90%后展開U251細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞展開實驗。觀察組:應(yīng)用五味子多糖作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，藥物濃度分別分成200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml。對照組:未應(yīng)用任何藥物干預(yù)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。

1. 3四甲基偶氮唑藍(lán)比色法( MTT)檢測細(xì)胞增殖情況MTT法觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測量吸光度( OD570)值。細(xì)胞增殖抑制率=( 1－觀察組OD570水平/對照組OD570水平)×100%。

1. 4 RT－PCR觀察組:應(yīng)用800 μg/ml五味子多糖作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。對照組:未應(yīng)用任何藥物干預(yù)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。RT－PCR觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞細(xì)胞周期素B1( cyclin B1) mRNA、原癌基因( c－Myc) mRNA的影響。獲取細(xì)胞總RNA，經(jīng)3次離心操作后棄上清液，干燥30 min，置于焦碳酸乙二酯( DEPC)水溶液中，分別檢測其濃度和質(zhì)量。選擇反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反應(yīng)，總RNA離心后置于冰上，將反應(yīng)體系在42℃下溫育1 h，95℃下加熱樣品5 min后置于5℃環(huán)境下，然后用TE緩沖液將第一鏈cDNA合成反應(yīng)的體積稀釋到100 μl，－20℃保存待檢。不同基因的特異引物見表1。RT－PCR反應(yīng)條件95℃，30 s; 40個循環(huán)( 95℃，5 s; 60℃，30 s)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

表1不同基因的特異引物

1. 5 Western印跡觀察組:應(yīng)用800 μg/ml五味子多糖作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。對照組:未應(yīng)用任何藥物干預(yù)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞。Western印跡觀察800 μg/ml五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響。收集人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸( BCA)法進(jìn)行蛋白含量測定，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠( SDSPAGE)膠電泳。把電泳后獲取的蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜，置于50 g/L BSA的Tris鹽酸緩沖液( TBST)中封閉4 h，一抗4℃孵育過夜，選用TBST徹底清洗，加羊抗兔Ⅱ抗并孵育1 h，再次使用TBST徹底清洗，最后通過化學(xué)增強發(fā)光法( ECL)測定蛋白的表達(dá)。所用內(nèi)參照均使用β－actin。圖像分析軟件AlphaImager 2200測定印跡區(qū)帶的光密度。

1. 6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗。

2結(jié)果

2. 1五味子多糖對U251細(xì)胞的增殖抑制培養(yǎng)48 h后，觀察組不同濃度用藥組OD570值均低于對照組，且隨著用藥濃度的上升，五味子多糖對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸加強趨勢。見表2。

表2五味子多糖對U251細(xì)胞的增殖抑制作用

2. 2五味子多糖對U251細(xì)胞cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA的影響觀察組cyclin B1 mRNA、c－Myc mRNA相對表達(dá)量均低于對照組( P＜0．05)。

2. 3五味子多糖對U251細(xì)胞cyclin B1、c－Myc蛋白的影響

觀察組cyclin B1、c－Myc蛋白表達(dá)量均低于對照組。見圖1。

圖1五味子多糖對U251細(xì)胞cyclin B1、c-Myc蛋白的影響

3討論

腫瘤屬于多基因疾病，不論是抑癌基因的失活還是癌基因的激活，都會引起腫瘤細(xì)胞的增殖〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖具有調(diào)節(jié)與細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白的水平，阻滯細(xì)胞周期，從而起到抑制腫瘤增殖的功效〔8〕。五味子多糖對腫瘤的防治作用的研究已經(jīng)成為現(xiàn)階段臨床研究的熱點〔5〕，但是應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療的報道并不多見。溫娜等〔9〕的研究顯示五味子多糖通過激活c－Jun N端液酶( JNK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時能夠提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，造成線粒體膜電位下降，促進(jìn)cytochromec的釋放，提高caspase－9的活性。

cyclin B1和DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔10〕，是調(diào)控細(xì)胞由G2期向M期轉(zhuǎn)換的重要因子之一。c－Myc是目前研究最為廣泛的癌基因之一〔11〕，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究表明五味子多糖通過抑制cyclin B1與c－Myc的表達(dá)起到抑制U251細(xì)胞增殖和G2/M期阻滯的作用。

4參考文獻(xiàn)

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2王曉東，陳善成，楊俊葆，等．星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中HSP70的表達(dá)及生物學(xué)活性〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2015; 35( 6) : 1477－9．

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7許娜，賴一鳴，陳曉潔，等．五味子多糖誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡及分子機(jī)制研究〔J〕．時珍國醫(yī)國藥，2013; 24( 5) : 1165－6．

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11 Wang C，Lisanti MP，Liao DJ．Reviewing once more the c－myc and Ras collaboration: converging at the cyclin D1－CDK4 complex and challenging basic concepts of cancer biology〔J〕．Cell Cycle，2011; 10 ( 1) : 57－67．

〔2015－06－11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:亢建民( 1964－)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)窺鏡微侵襲神經(jīng)外科、膠質(zhì)瘤外科治療研究。

基金項目:天津市自然科學(xué)基金項目( No．14JCZDJC35600)

〔中圖分類號〕R730

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0299-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 021