于紀(jì)棉　王建峰張玉琳　黃素文倪健波(寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江　寧波　3500)

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重組絲氨酸蛋白酶抑制劑對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的影響

于紀(jì)棉王建峰1張玉琳黃素文1倪健波1(寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波315100)

〔摘要〕目的探討重組絲氨酸蛋白酶抑制劑( Vaspin)對鏈脲佐菌素( STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的影響。方法通過體外表達(dá)獲得重組Vaspin蛋白。采用高脂飼料加小劑量注射STZ誘導(dǎo)2型糖尿病SD大鼠模型，對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射100 μl 0．5 mg/ml重組Vaspin蛋白，模型組以生理鹽水代替，每天給藥1次，連續(xù)給藥2 w后，進(jìn)行口服吐葡萄糖耐量( OGTT)試驗(yàn);分離血清，測定總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇( HDL－C)、空腹血糖( FBG)、空腹胰島素( FINS)以及腫瘤壞死因子( TNF)－α，瘦素( Lep)的水平。結(jié)果OGTT結(jié)果顯示經(jīng)過重組Vaspin蛋白腹腔注射治療后的糖尿病大鼠血糖變化曲線接近于正常，且2 h后下降至對照組大鼠水平。經(jīng)過Vaspin蛋白治療2 w后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的TC、TG、LDL和FBG、FINS、胰島素抵抗( IR)均顯著降低，脂肪因子Lep和TNF－α下降至正常水平。結(jié)論該研究獲得的重組Vaspin具有活性，可以降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的糖脂代謝和IR水平。

〔關(guān)鍵詞〕重組絲氨酸蛋白酶抑制劑;糖尿病大鼠模型;胰島素抵抗

1寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心

第一作者:于紀(jì)棉( 1983－)，女，講師，博士，主要從事病理和人體形態(tài)教學(xué)研究。

肥胖是2型糖尿病發(fā)病的獨(dú)立高危因素，可以引起胰島素抵抗( IR)和胰島素分泌功能障礙，而IR是2型糖尿病發(fā)病的一個重要原因〔1〕。最新研究證明，脂肪組織不僅是機(jī)體能量的儲存器，而且也是重要的內(nèi)分泌器官，它可分泌大量的脂肪因子〔2〕，這些脂肪因子可直接或間接影響機(jī)體糖脂代謝，與IR、2型糖尿病關(guān)系密切。內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑( Vaspin)是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，有研究表明，Vaspin在肥胖和2型糖尿病中起著重要的作用。本文通過對鏈脲佐菌素( STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠注射重組的Vaspin，觀察治療效果，探討其在改善IR中的作用機(jī)制。

1材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動物及分組清潔級SD雄性大鼠50只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動物許可證號: SCXK(浙) 20080033〕，隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病模型組、實(shí)驗(yàn)組。每組10只。

1. 2試劑和儀器STZ購自美國Sigma公司;胰島素( INS)、總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL－C)、高密度脂蛋白膽固醇( HDL－C)、腫瘤壞死因子( TNF)－α和瘦素( Lep)酶聯(lián)免疫吸附( ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司) ;重組Vaspin蛋白(本實(shí)驗(yàn)室保存) ;活力型血糖儀(美國羅氏公司) ;酶標(biāo)儀MD SpectraMax M5(美國MD公司)。

1. 3獲得重組Vaspin蛋白以大鼠睪丸脂肪細(xì)胞總RNA為模板，RT－PCR擴(kuò)增脂肪因子Vaspin基因，亞克隆到原核表達(dá)載體PET－30a獲得重組質(zhì)粒pET－30－Vaspin，轉(zhuǎn)化至E．coli BL21 ( DE3)菌株后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用Ni柱進(jìn)行純化以獲得重組Vaspin蛋白。

1. 4 2型糖尿病大鼠模型制備SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，參照參考文獻(xiàn)〔3〕復(fù)制糖尿病模型。采血前禁食12 h。測定大鼠空腹血糖( FBG)，以血糖含量大于16．7 mmol/L為大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1. 5口服葡萄糖耐受量試驗(yàn)將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。模型組和對照組腹腔注射100 μl生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射100 μl 0．3 mg/ml重組Vaspin蛋白，每天給藥1次，連續(xù)給藥2 w后，進(jìn)行口服葡萄糖耐受量試驗(yàn)( OGTT)，試驗(yàn)前大鼠禁食12 h，用10%葡萄糖溶液( 2 g/kg)灌胃，于灌胃前0 h、灌胃后0．5、1、2 h尾靜脈取血測定血糖。

1. 6血脂、IR和其他脂肪細(xì)胞因子的測定SD大鼠連續(xù)給藥2 w后，1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，靜置1 h后，4℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，置－20℃冰箱冷藏保存，用于空腹胰島素( FINS)、TC、TG、LDL－C、HDL－C以及TNF－α，Lep的測定。IR指數(shù)，采用穩(wěn)態(tài)模型評估法( HOMA)中的公式HOMA IR=FINS×FBG/22．5計算〔4〕。

1. 7統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2. 1 Vaspin對2型糖尿病大鼠OGTT的影響模型組大鼠在0、0．5、1、2 h的血糖水平均高于對照組和實(shí)驗(yàn)組( P＜0．01)，實(shí)驗(yàn)組在0、0．5、1、2 h的血糖水平與對照組之間無顯著變化。見表1。

表1重組Vaspin對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n=10，mmol/L)

表1重組Vaspin對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)的影響(±s，n=10，mmol/L)

與模型組比較: 1) P＜0．01，2) P＜0．05，下表同

組別　0 h　0．5 h　1 h　2 h對照組　6．01±0．411)　10．71±2．021)17．34±1．291)　7．68±0．871)模型組　17．86±1．03　 29．61±2．63　 34．48±3．21　 25．12±2．01實(shí)驗(yàn)組　8．86±0．571)　13．03±1．971)19．13±2．471)　9．09±0．561)

2. 2 Vaspin對2型糖尿病大鼠血脂的影響模型組大鼠TG、TC、LDL－C明顯高于對照組( P＜0．01，P＜0．05) ;實(shí)驗(yàn)組的TG、TC、LDL－C明顯低于模型組( P＜0．01，P＜0．05)，但與對照組相比無顯著差異。實(shí)驗(yàn)組和模型組HDL－C水平與對照組相比均無顯著變化。見表2。

2. 3 Vaspin對糖尿病大鼠FBG、FINS和IR的影響給藥2 w后，模型組大鼠FBG平均明顯高于對照組( P＜0．01) ;實(shí)驗(yàn)組大鼠FBG水平明顯低于模型組( P＜0．01)，但與對照組相比無顯著差異。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清FINS水平均明顯高于對照組( P＜0．01) ;實(shí)驗(yàn)組血清FINS水平與模型組相比顯著下降( P＜0．05)。模型組大鼠IR顯著高于對照組( P＜0．01) ;與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠IR顯著下降( P＜0．01)，但與對照組相比無顯著差異。見表3。

2. 4 Vaspin對脂肪因子Lep、TNF－α水平的影響與對照組比較，模型組Lep、TNF－α水平明顯高于對照組( P＜0．05) ;實(shí)驗(yàn)組Lep、TNF－α水平明顯低于模型組( P＜0．05)，但與對照組相比無顯著差異。見表4。

表2重組Vaspin對2型糖尿病大鼠空腹血脂的影響( n=10±s，mmol/L)

表2重組Vaspin對2型糖尿病大鼠空腹血脂的影響( n=10±s，mmol/L)

組別　TG　TC　HDL－C　LDL－C對照組　1．48±0．191)　0．66±0．181)　1．06±0．17　 0．91±0．052)模型組　2．37±0．21　 1．65±0．51　 1．26±0．25　 1．25±0．23實(shí)驗(yàn)組　1．81±0．081)　0．67±0．141)　1．17±0．31　 0．92±0．062)

表3重組Vaspin對2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影響( n=10±s)

表3重組Vaspin對2型糖尿病大鼠FBG、FINS、IR的影響( n=10±s)

組別　FBG( mmol/L)　 FINS( mU/L)　IR對照組　6．52±0．281)　22．51±3．331)　6．58±0．971)模型組　21．3±1．62　 35．3±8．07　 47．72±6．89實(shí)驗(yàn)組　7．03±0．881)　30．3±3．582)　9．47±1．061)

表4重組Vaspin對2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影響( n=10±s，ng/L)

表4重組Vaspin對2型糖尿病大鼠Lep和TNF-α的影響( n=10±s，ng/L)

組別　Lep　TNF－α對照組　7．51±0．412)　64．1±7．182)模型組　8．48±0．72　78．3±12．6實(shí)驗(yàn)組　7．87±0．452)　65．4±7．452)

3討論

Vaspin與其他脂肪因子相比，其獨(dú)特性在于主要在哺乳動物的內(nèi)臟脂肪組織中表達(dá)，并且與肥胖關(guān)系密切，正常糖調(diào)節(jié)人群中隨著BMI升高，表達(dá)Vaspin的個體比例也隨之增高，而非肥胖者脂肪組織中未檢測出Vaspin mRNA表達(dá)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)重組Vaspin蛋白具有明顯降血糖作用，并提示重組的Vaspin能改善由高脂高糖誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的胰島素敏感性，這與國外相關(guān)研究結(jié)果較為一致〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Vaspin對改善糖尿病大鼠糖代謝、脂代謝起積極的作用。國內(nèi)外的其他研究也證實(shí)Vaspin與血糖和血脂指標(biāo)的關(guān)系密切，并可能參與了糖、脂代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展〔7，8〕。朱慧靜等〔9〕對臨床上60多列單純性肥胖進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)Vaspin與INS及TG呈顯著正相關(guān)。

Lep也是由脂肪組織合成與分泌的一種細(xì)胞因子，具有加快能量消耗，抑制脂肪合成，調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶的作用，是能量和代謝的主要調(diào)節(jié)因子。本研究中糖尿病大鼠經(jīng)過重組Vaspin治療后，可以明顯降低糖尿病大鼠體內(nèi)Lep水平，推測Vaspin可能通過與Lep相互作用來調(diào)節(jié)能量代謝。相關(guān)研究也證實(shí)血清Lep水平在2型糖尿病患者中明顯高于正常者，Lep與糖尿病、IR緊密關(guān)聯(lián)〔10〕。前炎性反應(yīng)狀態(tài)是引起IR和胰島β細(xì)胞功能失調(diào)的重要標(biāo)志〔6〕。本研究中糖尿病大鼠經(jīng)過重組Vaspin治療后大鼠體內(nèi)TNF－α水平顯著降低，推測Vaspin可能通過抑制由脂肪因子或血管細(xì)胞來源的細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而改善IR。

夏常杰等〔11〕研究表明利拉魯肽治療2型糖尿病患者后，糖脂代謝及胰島β細(xì)胞功能改善，胰島素敏感性增加，同時患者血漿Vaspin水平升高;孫莉等〔12〕利用羅格列酮，體外作用于分化成熟的3T3－L1脂肪細(xì)胞，可以檢測到Vaspin mRNA表達(dá)上調(diào);由此推測某些治療2型糖尿病的藥物通過誘導(dǎo)Vaspin的表達(dá)水平來降低血糖，改善IR。而本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射Vaspin后使糖尿病大鼠空腹血糖和IR的水平降低，由此推測Vaspin可能成為有效的治療糖尿病途徑之一。

綜上所述，由高脂高糖和小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠，經(jīng)重組Vaspin治療后可降低糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病大鼠的血脂和IR，進(jìn)一步提示Vaspin與和2型糖尿病有密切關(guān)系，為2型糖尿病治療提供思路，但其降血糖的作用機(jī)制以及對IR的信號通路的影響尚需進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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2 Miner JL．The adipocyte as endocrine cell〔J〕．J Anim Sci，2004; 82: 935．

3于紀(jì)棉，張岳燦，張玉琳，等．SD大鼠2型糖尿病模型的建立〔J〕．浙江醫(yī)學(xué)，2012; 34( 24) : 1958－9．

4李光偉，潘孝仁，Lillioja S，等．檢測人群胰島素敏感性的一項(xiàng)新指數(shù)〔J〕．中華內(nèi)科雜志，1993; 32( 10) : 656．

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6 Hida K，Wada J，Eguchi J，et al．Visceral adipose tissue derived serine protease inhibitor: a unique insulin sensitizing adipocytokine in obesity 〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2005; 102( 30) : 10610－5．

7 Bluher M．Vaspin in obesity and diabetes: pathophysiological and clinical significance〔J〕．Endocrine，2012; 41( 2) : 176－82．

8陳燕，李伶，楊剛毅，等．糖代謝改善對2型糖尿病患者血漿vaspin水平的影響〔J〕．中國糖尿病雜志，2012; 20( 9) : 650－2．

9朱慧靜，成興波，魯燕．單純性肥胖者血清Vaspin水平與胰島素抵抗的相關(guān)性〔J〕．江蘇醫(yī)藥，2010; 36( 8) : 892－4．

10張靜．Vaspin、脂聯(lián)素、瘦素與糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)性的研究〔D〕．濟(jì)南:山東大學(xué)，2011．

11夏常杰，李伶，楊剛毅，等．利拉魯肽對2型糖尿病患者血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑水平的影響〔J〕．中國老年學(xué)雜志，2011; 31( 2) : 181－3．

12孫莉，王長江，代芳，等．白細(xì)胞介素－6和羅格列酮對3T3－L1脂肪細(xì)胞Vaspin mRNA表達(dá)的影響〔J〕．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009; 44( 1) : 26－31．

〔2014－09－17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者:王建峰( 1981－)，男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物模型、分子生物學(xué)的研究。

基金項(xiàng)目:浙江省教育廳科研項(xiàng)目( Y201432068) ;浙江省自然科學(xué)基金( Y12H070001) ;寧波市自然科學(xué)基金( 2011A610030)

〔中圖分類號〕R587. 1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0268-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 005