劉嬋　馬東升　于林芳

[摘要] 目的 分析長鏈非編碼RNAMEG3在胃癌組織中的表達水平，并探討MEG3過表達對胃癌細胞增殖產(chǎn)生的具體影響。方法 將正常胃組織和細胞作為對照組，將胃癌組織和細胞的MEG3表達水平作為觀察組，采用qRT-PCR（定量反轉(zhuǎn)錄PCR）技術對觀察組的MEG3表達水平進行檢測，利用轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3將其上調(diào)，檢測其轉(zhuǎn)染率。然后將上調(diào)后MEG3水平對BGC-823和MGC-803細胞的增殖能力的影響采用MTT實驗進行檢測，并對兩種細胞中的p53蛋白水平進行Western blot檢測。結(jié)果 （1）用熒光定量PCR測量36例胃癌組織及對應癌旁組織組正常組織中MEG3相對表達水平均存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（2）MGC-803和BGC-823細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和對照組比較，顯著上升310和251倍，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）經(jīng)MTT實驗，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823細胞的增殖能力顯著下降（P<0.05）。（4）和對照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達顯著增加（P<0.05）。結(jié)論 胃癌組織和細胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，從而導致胃癌細胞增殖，影響胃癌的發(fā)展進程。

[關鍵詞] 胃癌；細胞增殖；長鏈非編碼RNA；MEG3；具體影響

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2016）09-21-04

[Abstract] Objective To analyze the long non-coding RNA MEG3 expression levels in gastric cancer and explore MEG3 specific impact on gastric cancer cell proliferation by over-expression. Methods The normal gastric tissues and cells as the control group， the expression levels of gastric carcinoma cells and MEG3 as the observation group， using qRT-PCR（quantitative reverse transcription PCR） technique MEG3 expression levels in the observation group were detected using transfection pcDNA-MEG3 be raised， to detect the transfection efficiency. Then after impact MEG3 raise the level of proliferation of BGC-823 and MGC-803 cells using MTT assay testing， and by Western blot detection of two cells p53 protein levels. Results （1）measuring 36 cases of gastric cancer tissues and the corresponding normal tissues adjacent to cancer tissue groups in the presence of water on average relative expression MEG3 significant difference was statistically significant（P<0.05） with fluorescence quantitative PCR. （2）MGC-803 and BGC-823 cells were transfected with pcDNA-MEG3， compared with a significant increase in the level of the control group MEG3 310 and 251 times the difference between the groups was significantly（P<0.05）. （3）By MTT assay， after rising MEG3 level， proliferation MGC-803 and BGC-823 cells was significantly decreased（P<0.05）. （4）And the control group， MGC-803 and BGC-823 transfected pcDNA-MEG3， which significantly increased the expression of p53（P<0.05）. Conclusion The gastric cancer tissues and cells MEG3 decline can inhibit the activation of p53 protein， leading to gastric cancer cell proliferation and the development process of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer； Cell proliferation； Long chain non encoding RNA； MEG3；Specific effects

經(jīng)全球相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胃癌已經(jīng)成為癌癥死亡中的第二殺手，而且隨著人們飲食習慣的變化，該病的發(fā)生率正逐年上升[1-3]。由于胃癌早期并不具備典型的臨床癥狀，故確診人數(shù)有限，多以進展期的胃癌為主，而且大部分確診患者會伴隨腹

腔內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，所以很難取得令人滿意的臨床治療效果，預后效果不佳，5年生存率不足1/10[4-6]。正因如此，掌握胃癌的病理機制和分子水平的變化對于發(fā)展生物的診斷標志物具有重要意義，可以為胃癌的有效治療提供科學依據(jù)。長鏈非編碼RNA具有很多生物學功能，而且在很多生物進程中具有重要作用。有研究顯示[7-8]，lncRNA的變異和調(diào)節(jié)功能異常是導致腫瘤的重要因素，所以確定與癌癥密切相關的lncRNA，對其生物和分子學作用進行研究對于腫瘤的研究具有重要意義。為了分析長鏈非編碼RNAMEG3在胃癌組織中的表達水平，并探討MEG3過表達對胃癌細胞增殖產(chǎn)生的具體影響，我院進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院在2008年4月～2012年12月期間收治的胃癌手術治療患者共36例，入選者均符國際胃癌診斷和分期標準，且術前未接受任何局部或全身治療。將36例胃癌手術患者歸為觀察組，組內(nèi)男21例，女15例；年齡34～59歲，平均（48.3±3.9）歲。選取另36例胃部健康人群歸為對照組，組內(nèi)男20例，女16例；年齡32～58歲，平均（47.1±3.4）歲。兩組研究對象在性別、年齡等方面無明顯差異（P>0.05），具有可比性。

病理組織樣本采集后立刻行液氮冷凍，置于-80℃環(huán)境中保存待檢。本次研究經(jīng)我院倫理組織委員會批準，且患者均自愿簽署《知情同意書》。購置專業(yè)的SGC7901、MGC-803和BGC-823胃癌細胞系以及正常胃黏膜上皮細胞系GES-1，在37℃以及5%二氧化碳的恒溫箱中，上述細胞系均接受高糖DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素進行細菌培養(yǎng)，每24～48小時更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%～90%時開始傳代培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 提取RNA和qRT-PCR 將正常胃組織和細胞作為對照組，將胃癌組織和細胞的MEG3表達水平作為觀察組，采用TRIzol試劑（福州晶康生物技術有限公司；產(chǎn)品規(guī)格：100mL；產(chǎn)品編號：RP1001）提取培養(yǎng)細胞中或組織中的總RNA，通過轉(zhuǎn)錄盒使其反轉(zhuǎn)錄為cRNA，并使用專門試劑（一步法快速PCR檢測試劑盒，規(guī)格200×25μL，商品型號DDM0069A-25μL×200）進行實時PCR檢測。檢測結(jié)果采用GAPDH進行量化表達，記錄MEG3以及GAPDH的上下游PCR引物。在ABI 7500平臺上收集數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果，并采用標準方法對MEG3的表達進行計算。

1.2.2 構(gòu)建和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 MEG3序列經(jīng)合成和反克隆為pcDNA載體，經(jīng)pcDNA-MEG3轉(zhuǎn)染對MEG3的異常水平進行表達，并將空pcDNA載體作為對照，使用qPCR檢驗MEG3的表達水平。所有pcDNA-MEG3和空pcDNA載體均經(jīng)專門試劑盒提取，嚴格按照其說明書進行操作，將其轉(zhuǎn)染到6孔平板進行細胞培養(yǎng)，于2d后收集細胞進行qRT-PCR和Western blot分析，以及細胞增殖實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理

本次研究數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計分析，對重要指標進行給出95%CI區(qū)間，并對其相關數(shù)據(jù)進行χ2或t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中的MEG3水平

用熒光定量PCR測量36例胃癌組織及對應癌旁組織組正常組織中MEG3相對表達水平，其中MEG3表達水平為（△CT=8.1542±1.571），顯著低于癌旁正常組織中的表達水平（△CT=6.224±1.976），組間差異顯著（t=4.5872，P=0.025<0.05）具有統(tǒng)計學意義。

2.2 體外實驗外源性上調(diào)MEG3表達水平對胃癌細胞增殖的影響

MGC-803和BGC-823細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，MEG3水平和對照組比較，顯著上升310和251倍，組間差異顯著（t=2.036，P=0.002<0.05）。經(jīng)MTT實驗，MEG3水平上升后，MGC-803和BGC-823細胞的增殖能力顯著下降（t=3.632，P=0.000<0.05）。

2.3 MEG3誘導p53蛋白激活

和對照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達顯著增加（t=1.945，P=0.004<0.05）。具體見圖1。

3 討論

胃癌屬于多因素和異質(zhì)性的侵襲性疾病，是各種癌癥患者中死亡率較高的一種疾病類型，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)引起廣泛關注的公共衛(wèi)生問題。目前，胃癌很難徹底治愈，且預后效果和確診時胃癌的分期具有密切關聯(lián)，將癌組織完全切除是目前治療胃癌的唯一有效措施[9-11]。

在胃癌患者的細胞水平表達中，早期患者和遠期發(fā)展患者的一系列復雜分子的異常將會對正常細胞的功能造成嚴重影響，在遺傳和表觀遺傳學修飾的作用下，很多基因在正常細胞和受影響的細胞中的表達會存在明顯的差異。因此，對這些的發(fā)生異常變化的分子進行研究，對于深刻了解癌細胞生物學的行為機制以及胃癌具有重要意義[12-14]。

近年來，隨著長鏈非編碼RNA的研究逐漸深入，它的異常表達對胃癌發(fā)生以及發(fā)展機制的影響研究也開始深入[15-16]。所以，本次研究通過檢測長鏈非編碼 RNAMEG3在胃癌組織及細胞系中的表達水平，以及其過表達對胃癌細胞增殖能力的影響，以此來確立MEG3水平和胃癌發(fā)生發(fā)展的關系，結(jié)合前人實驗的MEG3對其他腫瘤細胞增殖的抑制機制，來推測其可能的在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制[17-19]。

在本次研究中，相對于正常健康胃部組織而言，存在癌細胞的胃部組織及細胞中的MEG3水平明顯更低，組間各細胞中的MEG3表達水平均存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這一結(jié)果說明，MEG3水平可成為胃癌的診斷依據(jù)。和對照組比較，MGC-803和BGC-823經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3后，其中p53的表達顯著增加（P<0.05）。這一結(jié)果充分說明，提高MGC-803和BGC-823細胞中的MEG3水平有助于提高p53的表達，可能提示MGC-803和BGC-823MEG3在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能通過促進p53的激活而發(fā)揮抑癌作用[20-23]。

由此可知，胃癌組織和細胞中的MEG3下降可以抑制p53蛋白的激活，從而導致胃癌細胞增殖，影響胃癌的發(fā)展進程。當然，MEG3水平對胃癌細胞增殖的影響可能不僅僅限于p53，所以還有待進行更深入的后續(xù)研究。

[參考文獻]

[1] 孫倩，劉博巽，林夢潔，等.長鏈非編碼RNAMEG3對胃癌細胞增殖的影響[J].南京醫(yī)科大學學報（自然科學版），2014，12（1）：1-6.

[2] 史浩駿，王志剛.長鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2014，15（8）：1254-1259.

[3] 陳杰，朱成杰，商艷，等.長鏈非編碼RNA與肺癌[J].第二軍醫(yī)大學學報，2014，33（10）：1115-1120.

[4] 胡倩，姚和瑞.長鏈非編碼RNA與腫瘤研究現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志，2014，25（21）：1746-1750.

[5] 潘超，楊坤興.長鏈非編碼RNA在胰腺癌中的研究進展[J].世界華人消化雜志，2015，18（4）：563-569.

[6] 尹艷桃，倪亞光，覃麗.lncRNA在腫瘤中的表達及作用機制[J].中國生物化學與分子生物學報，2015，3（4）：352-359.

[7] 王瑞國，沈遠，李清，等.DNA損傷誘導的長鏈非編碼RNA-UCA1促進HeLa細胞增殖[J].中國生物化學與分子生物學報，2015，11（5）：505-513.

[8] 張丹，侯小麗，吳博，等.長鏈非編碼RNA在食管癌中的研究進展[J].世界華人消化雜志，2015，21（17）：2744-2753.

[9] 姜鶴宇，鄒健，于曉峰.長鏈非編碼RNA在結(jié)直腸癌中的表達與調(diào)控機制[J].世界華人消化雜志，2015，23（22）：3567-3575.

[10] 師雅斌，郭煒，崔建利，等.非編碼長鏈RNA LOC100130476在食管鱗癌中的表達及其甲基化狀態(tài)[J].腫瘤，2015，16（8）：866-873.

[11] 張娜，季萬勝，楊炳乾，等.腫瘤壞死因子對不同分化程度胃癌細胞增殖及Δ133p53表達的影響[J].中國腫瘤，2015，24（4）：335-339.

[12] 張哲，郭昊，董加強，等.長鏈非編碼RNA UCA1在胃癌多藥耐藥中的作用研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（15）：2811-2814，2819.

[13] 唐龍，唐世磊，劉古月，等.長鏈非編碼RNA在常見消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進展[J].中國普外基礎與臨床雜志，2015，22（8）：1014-1018.

[14] 田志華，丁慧榮，張宏，等.不同惡化程度胃癌細胞系的細胞間隙連接通訊功能及Cx43表達的差異[J].北京師范大學學報（自然科學版），2011，47（1）：63-68.

[15] 周海燕，王寬松，胡忠良，等.miR-193b對胃癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的影響[J].中國普通外科雜志，2011，20（4）：377-382.

[16] 史海濤，董蕾，黨曉燕，等.中藥SPPW方劑對人胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（7）：921-925.

[17] 史福軍，黃宗海，厲周，等.鞘氨醇激酶促進胃癌細胞SGC-7901轉(zhuǎn)移和侵襲[J].第三軍醫(yī)大學學報，2014，36（1）：25-28.

[18] 段勤勤，高青，李開庭，等.蘆薈大黃素納米脂質(zhì)體介導的光動力對胃癌細胞的作用[J].重慶醫(yī)科大學學報，2014，39（3）：305-309.

[19] 李靖，錢軍，賈建光，等.四君子湯對胃癌細胞株SGC-7901側(cè)群細胞增殖的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（6）：704-709.

[20] 曾怡，周建獎，謝淵，等.沉默胃泌素基因抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[J].中國生物化學與分子生物學報，2014，30（9）：905-911.

[21] 李超，胡偉國，趙紅超，等.腫瘤相關成纖維細胞通過轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)節(jié)胃癌細胞轉(zhuǎn)移能力的研究[J].外科理論與實踐，2014，19（4）：335-341.

[22] 穆媛媛，吳會超，楊瑩瑩，等.胃泌素及其受體拮抗劑對人胃癌細胞株MKN45增殖及HB-EGF表達的影響[J].腫瘤防治研究，2012，39（2）：133-136.

[23] 劉包欣子，王瑞平，鄒璽，等.常春藤皂苷元對胃癌細胞MGC-803增殖、黏附、侵襲和遷移能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（4）：212-215.

（收稿日期：2015-12-02）