楊文慧　郭　濤楊　莉　華寶桐楊　萍王　鈺(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院老年病科，云南　昆明　65005)

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體外心臟震波對大鼠心肌梗死后心肌凋亡的影響

楊文慧郭濤1楊莉華寶桐1楊萍1王鈺1
(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院老年病科，云南昆明650051)

〔摘要〕目的研究體外心臟震波治療( CSWT)對大鼠心肌梗死后( MI)心肌細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白的影響。方法結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型，隨機(jī)分為假手術(shù)( Sham)組( n = 10)、MI組( n = 10)及CSWT組( n = 10)。CSWT治療4 w后，取各組心肌樣本進(jìn)行TUNEL檢測觀察心肌細(xì)胞凋亡，Masson染色觀察心肌纖維化，Western印跡檢測Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達(dá)。結(jié)果與Sham組相比，MI和CSWT組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及纖維化程度均增高，Bax和Caspase－3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl－2表達(dá)明顯下調(diào)( P＜0．05) ;而CSWT組較MI組，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及纖維化程度均降低，Bax和Caspase－3表達(dá)下調(diào)，Bcl－2則表達(dá)上調(diào)( P＜0．05)。結(jié)論大鼠心肌梗死后心肌凋亡明顯增加，體外心臟震波可抑制大鼠心肌梗死后細(xì)胞凋亡，減輕左心室纖維化。

〔關(guān)鍵詞〕體外心臟震波;心肌梗死;凋亡

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者:楊文慧( 1982－)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病、心律失常的基礎(chǔ)及臨床研究。

體外心臟震波治療( CSWT)是一項(xiàng)新興的缺血性心臟病治療方法。CSWT通過體外導(dǎo)入低能量機(jī)械脈沖，在心肌組織中產(chǎn)生剪切力和空穴效應(yīng)，促進(jìn)多種生長因子表達(dá)，誘導(dǎo)缺血心肌局部血管新生，從而改善心肌灌注和微循環(huán)，減輕缺血性心臟病患者癥狀并改善其心功能〔1〕。心肌細(xì)胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因。減輕和抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可以改善心肌梗死患者的預(yù)后。本課題擬探究CSWT對大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響以及相關(guān)凋亡蛋白的變化情況。

1材料與方法

1. 1主要儀器和試劑體外心臟震波治療儀(瑞士STORZ MEDICAL公司，MODULITH SLC)，熒光顯微鏡(日本Olympus BX53)，小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALCV9)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf 5804R)，凝膠成像系統(tǒng)(美國GE ImageQuant LAS 4000)。DeadEnd TUNEL比色法檢測系統(tǒng)(美國Promega)，Masson三色染色液(珠海貝索) ; BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo)。Bax、Bcl－2、Caspase－3抗體(德國Millipore)，GAPDH抗體(美國Santa)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Thermo)，異氟烷(上海雅培)等。

1. 2實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型構(gòu)建選取健康雄性SD大鼠30只，體重( 230±35) g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔SCXK(湘) 2013－0004〕。隨機(jī)分為假手術(shù)組( Sham)、心肌梗死組( MI)和心臟震波治療組( CSWT)，每組10只。MI和CSWT組建立心肌梗死模型:于左心耳下方1～2 mm處與肺動(dòng)脈圓錐間結(jié)扎大鼠左前降支冠狀動(dòng)脈〔2〕。見心尖處心肌變蒼白、搏動(dòng)減弱為結(jié)扎成功。Sham組不行冠脈結(jié)扎，其余操作步驟同其他兩組。術(shù)后，Sham組和MI組僅給予常規(guī)飼喂，無其他特殊處理; CSWT組進(jìn)行體外心臟震波治療4 w。

1. 3大鼠CSWT CSWT組在建模后第2天開始CSWT，每周1、3、5進(jìn)行，治療4 w，共12次。異氟烷吸入麻醉大鼠，仰臥位固定。心臟震波儀探頭水囊緊貼大鼠左胸壁心臟搏動(dòng)處后開始脈沖發(fā)放。每次治療發(fā)放200次脈沖，頻率60次/min，震波能量0．24 mJ/mm2〔3，4〕。

1. 4 TUNEL比色法檢測心肌細(xì)胞凋亡大鼠心肌組織切片60℃烤箱中烘烤20 min，二甲苯和乙醇梯度脫蠟和水化，0．85%氯化鈉溶液浸洗5 min，PBS浸洗5 min，之后嚴(yán)格按照Dead－EndTMColorimetric TUNEL System試劑盒操作說明進(jìn)行染色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。切片干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞核染成棕黃色為陽性。每張切片在梗死邊緣區(qū)隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，記錄凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)目，計(jì)算凋亡指數(shù)( AI)，AI( %) =凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1. 5 Masson染色檢測心肌纖維化大鼠左室心肌4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋。每個(gè)心肌組織樣品連續(xù)切片3張，厚度5 μm。染色前，60℃烤箱中烘烤切片20 min，二甲苯和乙醇梯度脫蠟和水化。按Masson三色染色液說明書進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察，每張切片分別隨機(jī)選取5個(gè)HPFs (×400)進(jìn)行觀察。Image－pro Plus 6．0軟件測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)( CVF) = (膠原面積/全視野心肌總面積)×100%。

1. 6 Western印跡檢測Bax、Bcl－2、Caspase－3的表達(dá)分別取各樣本心肌組織20 mg，加入RIPA裂解液，高速電動(dòng)勻漿器充分勻漿，冰上超聲破碎細(xì)胞，然后13 000 g、4℃離心5 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白樣品加入等體積2×sample buffer，金屬浴95℃5 min，冷卻后4℃保存。制備SDS－PAGE，每孔蛋白上樣量50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗(抗Bax、抗Bcl－2、抗Caspase－3、抗GAPDH) 4℃孵育過夜。緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1 h后進(jìn)行成像。以GAPDH作為內(nèi)參，Image－Pro Plus 6．0軟件測定條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，多樣本間比較采用One－Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法。

2結(jié)果

2. 1心肌細(xì)胞凋亡的分布經(jīng)TUNEL染色及蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后心肌凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。MI組和CSWT組梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多棕色的細(xì)胞核碎裂顆粒。MI組和CSWT組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于Sham組( 29．91±2．96，15．42±1．33 vs 1．30±0．41) %，而CSWT組心肌凋亡指數(shù)明顯低于MI組( 29．91±2．96 vs 15．42±1．33) %，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)，見圖1。

2. 2心肌纖維化程度Masson三色染色使正常心肌染成紅色，纖維組織染成藍(lán)色。MI組心肌纖維化較Sham組和CSWT組明顯，心肌纖維排列紊亂，膠原沉積明顯。CSWT組心室肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)( 18．70±13．06) %高于Sham組( 0．31± 0．17) %，但低于MI組( 70．70±12．34) %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)，見圖2。

2. 3心肌Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白表達(dá)Bcl－2蛋白在CSWT 組( 1．08±0．03)和Sham組( 1．02±0．02)中的相對表達(dá)量明顯高于MI組( 0．10±0．02) ( P＜0．01)。Bax蛋白在CSWT組( 0．65±0．05)與MI組( 1．10±0．10)中的相對表達(dá)量均較Sham 組( 0．30±0．01)升高( P＜0．01)，而CSWT組Bax蛋白表達(dá)較MI組則顯著下降( P＜0．01)。Caspase－3蛋白在CSWT組( 0．30±0．02)與MI組( 1．31±0．12)中的相對表達(dá)量均較Sham 組( 0．01±0．00)升高( P＜0．01)，其中CSWT組較MI組顯著下降( P＜0．01)，見圖3。

圖1 TUNEL比色法檢測心肌凋亡(×400)

圖2 Masson三色染色檢測心肌纖維化(×200)

圖3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達(dá)量

3討論

缺血缺氧可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，存活心肌數(shù)量逐漸減少而出現(xiàn)左心室擴(kuò)張、收縮功能減退以及左室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭〔5〕。缺血缺氧等影響心肌細(xì)胞凋亡的因素主要通過死亡受體通路和線粒體通路傳遞促凋亡信號(hào)，激活凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因( Bax、wp53、和APO－1/Fas等)和抑制細(xì)胞凋亡基因( Bcl－2、mpl和ras等)〔6〕。其中，線粒體通路是從線粒體釋放細(xì)胞色素C開始的，受Bcl－2基因家族調(diào)控，包括凋亡抑制基因Bcl－2和凋亡促進(jìn)基因bax。在急性心肌梗死患者的人體心肌組織樣本中可觀察到大量凋亡小體，并且伴有Caspase－3高表達(dá)和Bcl－2低表達(dá)〔5〕。Bax是低氧應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的上游調(diào)控因子，低氧可促進(jìn)Bax蛋白構(gòu)象發(fā)生改變而被激活，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放;而Bcl－2則對Bax誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C這一過程起抑制作用。而當(dāng)細(xì)胞色素C從線粒體膜空隙釋放至細(xì)胞質(zhì)后可進(jìn)一步激活下游Caspase－3。Caspase－3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，也是凋亡途徑中處于中心地位的執(zhí)行者，被激活后可通過激活脫氧核糖核酸酶引起DNA降解、細(xì)胞凋亡〔7〕。

目前研究認(rèn)為CSWT是無創(chuàng)的治療缺血性心臟病的有效方法之一。該治療系統(tǒng)可釋放類似聚焦超聲波的低能量機(jī)械震蕩波，在心肌組織細(xì)胞間產(chǎn)生“空穴效應(yīng)”并形成大量微氣泡，微氣泡膨脹繼而發(fā)生非球面性破裂，對周圍的心肌細(xì)胞形成快速而短暫的剪切力，誘導(dǎo)VEGF及其受體Flt－1、NO、IGF、IL－8等表達(dá)上調(diào)，在冠脈原有微血管床基礎(chǔ)上促進(jìn)新生血管形成，從而改善缺血心肌的微循環(huán)及代謝〔3，8〕，減輕心室重構(gòu)〔9〕。在慢性心肌缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)中，觀察到CSWT可完全恢復(fù)左心室射血分?jǐn)?shù)( LVEF)和室壁增厚率( WT)、局部心肌血流。而在豬急性心肌梗死模型中，CSWT組較對照組明顯改善其左心室射血分?jǐn)?shù)〔10〕。臨床研究也顯示，CSWT可改善冠心病患者心肌灌注和心肌代謝，減輕心絞痛癥狀、減少硝酸甘油用量、改善心功能、提高運(yùn)動(dòng)耐量，并且具有良好安全性〔9，11〕。但CSWT對缺血缺氧心肌細(xì)胞凋亡的影響作用的研究尚少。Yu等〔12〕在體外缺氧環(huán)境下培養(yǎng)H9c2細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并給予CSWT處理(最大能量0．12 mJ/mm2，500次脈沖)，結(jié)果H9c2細(xì)胞凋亡減少，Bcl－2表達(dá)明顯上調(diào)，而Bax和Caspase－3表達(dá)下調(diào)。在豬急性心肌梗死模型中，CSWT治療組心肌中Bcl－2的mRNA水平上調(diào)，Bax和Caspase－3的mRNA水平下調(diào)，并且線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)量也明顯降低〔13〕。而在本研究中，我們通過建立大鼠急性心肌梗死模型模擬人體急性心肌梗死的病理過程，后經(jīng)CSWT治療4 w，CSWT組心肌凋亡指數(shù)及心肌纖維化程度較MI組明顯降低;蛋白水平檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化情況發(fā)現(xiàn)Bcl－2表達(dá)明顯上調(diào)，而Bax和Caspase－3表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)果進(jìn)一步提示CSWT可通過抑制線粒體通路傳遞的促凋亡信號(hào)，抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而減輕缺血缺氧后心肌細(xì)胞凋亡及纖維化程度。

心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)及其邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞由于缺血缺氧的刺激發(fā)生壞死和凋亡。另外，由于心功能降低，左室舒張末壓升高，室壁張力增高，心臟舒張期機(jī)械負(fù)荷加重，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，可引起慢性、持續(xù)性氧化代謝上調(diào)，致氧化負(fù)荷增高，激活應(yīng)激活化蛋白激酶，引起梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡〔14〕。梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡是引起左心室收縮功能降低和早期重構(gòu)的重要因素，而梗死邊緣區(qū)以及非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡則主要導(dǎo)致晚期心功能不全和左心室重構(gòu)〔15〕。本研究中CSWT組心肌梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較MI組明顯降低，提示CSWT治療可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，挽救梗死邊緣區(qū)缺血缺氧的心肌細(xì)胞，從而能減輕左心室收縮功能下降和左心室重構(gòu)，改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后。這與CSWT相關(guān)臨床研究結(jié)果相符。因此，通過CSWT體外無創(chuàng)物理治療方法阻斷凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少細(xì)胞凋亡及遲發(fā)性細(xì)胞壞死，可能是減少缺血區(qū)心肌細(xì)胞死亡的一條有效途徑。然而，CSWT如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍需進(jìn)一步深入探究。

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〔2015－10－17修回〕

(編輯李相軍)

The effect of cardiac shock wave therapy on apoptosis of cardiomyocytes and apoptosis-related protein expression in rats with myocardial infarction

YANG Wen-Hui，GUO Tao，YANG Li，et al.
Department of Gerontology，Yan＇an Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan，China

【Abstract】Objective To studythe effect of cardiac shock wave therapy ( CSWT) on the apoptosis of cardiomyocytes and apoptosisrelated protein expression in rats with myocardial infarction( MI) and to explore the mechanism of CSWT in ischemic cardiomyopathy．Methods Thirty healthy SD rats were divided into Sham( n=10)，MI( n=10)，CSWT groups ( n=10)．And the MI model was established by permanent ligation of the left anterior descending artery ( LAD)．After 4 weeks of CSWT treatment，myocardial samples from all groups were prepared for TUNEL and Masson staining．The expressions of Bax，Bcl－2 and Caspase－3 were detected by Western blot．Results Compared with those of sham group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were increased obviously in MI and CSWT group．Bax and Caspase－3 expressions were increased，but Bcl－2 expression level was decreased ( P＜0．05)．Compared with those of MI group，the myocardial apoptosis index and the degree of fibrosis were decreased in CSWT group．At the same time，Bax and Caspase－3 expressions were decreased，as well as Bcl－2 expression level was increased ( P＜0．05)．Conclusions Myocardial apoptosis will be deteriorated greatly after MI of rats．However，CSWT could inhibit cardiomyocytes apoptosis and reduce fibrosis in left ventricular following MI．

【Key words】Cardiac shock wave therapy; Myocardial infarction; Apoptosis

通訊作者:郭濤( 1957－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病、心律失常的基礎(chǔ)及臨床研究。

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81260027) ;云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目( 2014FZ051)

〔中圖分類號(hào)〕R541. 4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0265-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 004